細胞檢測的方法(檢測細胞增殖的方法)
1.檢測細胞增殖的方法有哪些
一、MTT比色：
MTT比色是一種目前被廣泛采用的檢測細胞生長(cháng)和存活的方法，其原理是外源性MTT（四唑鹽）可被活細胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶的藍紫色結晶物并沉淀在細胞中，而死細胞無(wú)此功能，DMSO（二甲基亞砜）能溶解細胞中的紫色結晶物，用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長(cháng)處檢測其光密度值，可間接反映活細胞數量。在一定范圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比，此方法已廣泛用于檢測細胞活力、觀(guān)察細胞生長(cháng)等方面，具有靈敏度高、重復性好、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟、快速、易自動(dòng)化、無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，與細胞計數有良好的相關(guān)性。
二、rdU標記法
1.細胞以1.5*105/ml細胞數接種于直徑35ml培養皿中（內放置一蓋玻片），培養1天，用含0.4% FCS培養液同步化3天，使絕大多數細胞處于G0期。
2.終止細胞培養前，加入BrdU（終濃度為30μg/L）,37℃，孵育40min。
3.棄培養液，玻片用PBS洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經(jīng)固定的玻片空氣干燥，0.3%H2O2-甲醇30min滅活內源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲酰胺100℃，5min變性核酸。
8.冰浴冷卻后PBS洗滌，加1抗即抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1:50），陰性對照加PBS或血清。
9.按ABC法進(jìn)行檢測，蘇木素或伊紅襯染，在顯微鏡下隨機計數10個(gè)高倍視野中細胞總數及BrdU陽(yáng)性細胞數，計算標記指數（LI）。
三、結晶紫法
1.體外細胞培養結束后，去培養液，加入11%的戊二醛固定，置于振蕩器上搖20min。
2.固定細胞用去離子水洗滌至戊二醛液洗凈。
3.置空氣或烘箱37℃徹底干燥。
4.加入0.1%的結晶紫液對細胞染色，振搖30min。
5.用蒸餾水洗滌，至多余的結晶紫液沖洗干凈。
6.置空氣或37℃烘箱中徹底干燥。
7.加入10%的乙酸對細胞吸收的結晶紫進(jìn)行提取。
8.1h后在酶標儀上測定光吸收度，波長(cháng)595nm。
四、酸性磷酸酶法
1.96孔細胞培養板中培養細胞，去培養液。用0.01mol/L PBS洗滌1次（如為懸浮細胞則用離心洗滌）。
2.去洗滌液后加入磷酸酶底物100μl/孔。
3.37℃，孵育1~4h。
4.加入0.1mol/L氫氧化鈉10μl/孔。
5.在多孔酶標儀上405nm處測光吸收度，將細胞培養板其中不含細胞，同樣處理過(guò)的一孔作為空白對照，所測的每孔光吸收度可間接反應每孔中的細胞數。如在同樣條件下作一細胞數的系列標準對照，以細胞數為X軸，光吸收度為Y軸，可作直線(xiàn)回歸，可推算出每孔中的細胞。
2.細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法
細胞免疫（CMⅠ）是由多種細胞相互作用的結果。
免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類(lèi)因子活性測定，因此評價(jià)機體的細胞免疫功能不僅程序復雜，且很難標準化。
一、遲發(fā)型過(guò)敏反應的體外檢測方法皮膚試驗和接觸性過(guò)敏的誘發(fā)是檢測遲發(fā)型過(guò)敏反應（DTH）的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發(fā)對曾經(jīng)使病人致敏的抗原的再次應答，而接觸性過(guò)敏是測試受者對從未接觸過(guò)的物質(zhì)發(fā)生致敏的能力。
1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類(lèi)試驗時(shí)在前臂皮內注射少量可溶性抗原，24~48小后，測量紅腫硬結的大小，硬結直徑大于10mm即被看作為陽(yáng)性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無(wú)反應，可用更高濃度的抗原重復試驗，若仍無(wú)反應即為陰性，需排除皮試技術(shù)誤差，也可能受試者從未接觸過(guò)此抗原，也可能由于細胞免疫功能缺損，或由于細胞免疫功能缺損，或由于嚴重感染（麻疹、慢性播散性結核）造成的無(wú)反應性。
2.接觸性過(guò)敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）誘生接觸性過(guò)敏。化合物與皮膚蛋白質(zhì)結合而導至DTH反應。
在動(dòng)物試驗時(shí)，初次皮膚上涂抹DNCB后間隔7~10天再激發(fā)刺激，則皮膚出現即為陽(yáng)性。此試驗人類(lèi)已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法體外檢測淋巴細胞的數量和功能，最易采集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊于淋巴細胞分層液之上離心時(shí)，由于紅細胞（1.092）、多形核白細胞（1.090）、淋巴細胞（1.070）的比重不同而相互分開(kāi)。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。
仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞占80%，單核細胞占20%，淋巴細胞中T細胞占80%,B細胞占4%~10%，其作為非DT、非B細胞。1.T細胞計數（1）E花環(huán)法：人類(lèi)T細胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結合形成玫瑰花環(huán)樣結構，將經(jīng)分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經(jīng)37℃培養5~10分鐘放4℃過(guò)夜，取細胞懸計數，外周血淋巴細胞中約70%~80%淋巴細胞結成花環(huán)即為T(mén)細胞。
目前此方法已用來(lái)分離T細胞，而不用做T細胞計數。（2）用單克隆抗體計數T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進(jìn)行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱(chēng)為CD3 細胞即總T細胞。
正常人在PBM中T細胞占70%~80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應與CD3 細胞數一致。
CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小于1.7。2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質(zhì)稱(chēng)為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。
T細胞轉化過(guò)程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成增加，最圖導致細胞分裂。在光學(xué)顯微鏡下可計數轉化后的淋巴細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量?jì)x檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。
最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱(chēng)為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線(xiàn)粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產(chǎn)生藍黑色甲（fromazan）產(chǎn)物。該產(chǎn)物的多少與活性細胞數正相關(guān)。
結果可用酶標檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行，并能反應試驗中的活細胞數。
3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，于37℃培養1小時(shí)左右，51Cr即可進(jìn)入靶細胞，與胞漿蛋白結合，洗去游離的51Cr后，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50:1或100:1）靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。
用γ射線(xiàn)測量?jì)x檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全，及經(jīng)IgG介導的ADCC效應，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4.混合淋巴細胞的反應（MIR） 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來(lái)篩選骨髓移植的供體。來(lái)自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4~5天，在最后8小時(shí)摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。
或用細胞毒法觀(guān)察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合（靶細胞來(lái)自與刺激細胞相同的個(gè)體）如果T細胞受刺激后產(chǎn)生了細胞毒T細胞，可殺死活的細胞，根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動(dòng)抑制因子）和LIF（白細胞移動(dòng)抑制因子）來(lái)評估細胞免疫功能。近年來(lái)應用測定IL-2的免疫酶技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，并能定量以取代了MIF和LIF的測定。
單個(gè)核細胞與分裂原。
3.檢測細胞凋亡的方法有哪些
一、形態(tài)學(xué)觀(guān)察方法 1、HE染色、光鏡觀(guān)察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀(guān)察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見(jiàn)細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進(jìn)入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。
此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。 4、透射電鏡觀(guān)察：可見(jiàn)凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、DNA凝膠電泳 （一）檢測原理 細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點(diǎn)均有規律的發(fā)生在核小體之間，出現180-200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的死亡，并可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷 正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類(lèi)似血抹片時(shí)的連續性條帶。 三、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）核小體測定 凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內出現核小體。
核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。 （一）檢測步驟 1、將凋亡細胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體； 2、在微定量板上吸附組蛋白體； 3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合； 4、加辣過(guò)氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合； 5、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途 該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。
該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。 四、流式細胞儀分析 （一）檢測原理 細胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細胞與壞死細胞之間。
利用一特點(diǎn)，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來(lái)區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。 （二）應用價(jià)值 流式細胞儀檢測具有以下特點(diǎn)： 1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態(tài)比較準確 2）、可以做許多相關(guān)性分析 3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期 ■檢測形態(tài)學(xué)及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法 細胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點(diǎn)，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來(lái)區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。 ■DNA片斷原位標記法 凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術(shù)是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解后3.的羥基（-OH）端結合，經(jīng)顯色反應后檢測DNA裂解點(diǎn)的技術(shù)。
DNA片段原位標記法有二種： 1、原位缺口轉移（in situ nick-translation,ISNT）技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3-OH端 2、原位缺口末端標記技術(shù)（in situ end labelling technique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高于ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL為合適。
■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法 1、原理：在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V(Annexin V)是鈣依賴(lài)性的磷脂結合蛋白，它于PS具有高度的結合力。
因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂酰絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時(shí)結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露于細胞膜外測，且對PI高染）進(jìn)行凋亡細胞雙染法后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。 3、應用價(jià)值：細胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。
又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
4.細胞活力測定的方法有哪些
根據每個(gè)細胞有一定的重量而設計的。
它可以用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長(cháng)的測定。將一定體積的樣品通過(guò)離心或過(guò)濾將菌體分離出來(lái)，經(jīng)洗滌，再離心后直接稱(chēng)重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過(guò)濾后用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱(chēng)重求出濕重。
不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器內冷卻，再稱(chēng)量，求出微生物干重。如果要測定固體培養基上生長(cháng)的放線(xiàn)菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過(guò)濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然后按上述方法求出菌絲體的濕重或干重。
除了干重、濕重反映細胞物質(zhì)重量外，還可以通過(guò)測定細胞中蛋白質(zhì)或DNA的含量反映細胞物質(zhì)的量。蛋白質(zhì)是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素。
從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌后，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16%，細菌中蛋白質(zhì)含量占細菌固形物的50%一80%，一般以65%為代表，有些細菌則只占13%一14%，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產(chǎn)生的。
因此總含氮量與蛋白質(zhì)總量之間的關(guān)系可按下列公式計算：蛋白質(zhì)總量=含氮量*6.25核酸DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)，每個(gè)細菌的DNA含量相當恒定，平均為8.4*`10^(-5)`NG。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。
5.免疫學(xué)的檢測方法有哪些
免疫學(xué)檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。
體液免疫：
所謂體液免疫，即以B細胞產(chǎn)生抗體來(lái)達到保護目的的免疫機制。負責體液免疫的細胞是B細胞。體液免疫的抗原多為相對分子質(zhì)量在10,000以上的蛋白質(zhì)和多糖大分子，病毒顆粒和細菌表面都帶有不同的抗原，所以都能引起體液免疫。
臨床上一個(gè)反復發(fā)作的化膿感染，常使醫生想到患者是否有免疫缺陷病，一般原發(fā)免疫缺陷發(fā)病年齡很小，而繼發(fā)免疫缺陷病人多在30歲以上。絕大多數免疫缺陷病人多表現為體液和細胞免疫同時(shí)受損，所以應全面檢查這兩方面的功能。遺憾的是，目前應用的檢測方法的局限性，其結果常難以得出明確結論。
細胞免疫：
T細胞受到抗原刺激后，增殖、分化、轉化為致敏T細胞（也叫效應T細胞），當相同抗原再次進(jìn)入機體的細胞中時(shí)，致敏T細胞（效應T細胞）對抗原的直接殺傷作用及致敏T細胞所釋放的細胞因子的協(xié)同殺傷作用，統稱(chēng)為細胞免疫。
在抗感染免疫中，細胞免疫主要參與對胞內寄生的病原微生物的免疫應答及對腫瘤細胞的免疫應答，參與遲發(fā)型變態(tài)反應和自身免疫病的形成，參與移植排斥反應及對體液免疫的調節。也可以說(shuō)，在抗感染免疫中，細胞免疫既是抗感染免疫的主要力量，參與免疫防護；又是導致免疫病理的重要因素。
6.細胞凋亡常用的檢測方法有哪些
1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
(1) 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發(fā)泡現象，細胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
(2) 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
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7.細胞活性檢測的方法有多少種
細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H 放射性同位素摻入法、MTT 法等。
其中 MTT 法以其快速簡(jiǎn)便，不需要特殊檢測儀器、無(wú)放射性同位素、適合大批量檢測的特點(diǎn)而得到廣泛的應用。但 MTT 法形成的 Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì )有可能帶走小部分的 Formazan ，故有時(shí)重復性略差。
為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員又開(kāi)發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類(lèi)：如 XTT 、CCK-8 ( WST-8 )等。
