檢驗蛋白質(zhì)含量的方法方法(測定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)
1.測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么
Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們去尋找更好的蛋 白質(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質(zhì)與染料相結合的原理設計的。這種蛋白 質(zhì)測定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應用。
這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。
在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1?g。
這是因為蛋白質(zhì)與染料結合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。
完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。
因而完全不用像Lowry法那樣費時(shí)和嚴格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。
如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測定法。
2.常用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無(wú)機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來(lái)并為過(guò)量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。
由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。
優(yōu)點(diǎn)：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對比較簡(jiǎn)單；實(shí)驗費用較低；結果準確，是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進(jìn)方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)。
缺點(diǎn)：凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應，把低價(jià)氮氧化并轉為氨鹽來(lái)測定，而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個(gè)用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個(gè)堿性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。
當底物中含有肽鍵時(shí)（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過(guò)比色法分析濃度，在紫外可見(jiàn)光譜中的波長(cháng)為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質(zhì)單位1-10mg。
優(yōu)點(diǎn)：測定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。
缺點(diǎn)：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì )干擾該反應。
3、酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，不加標準蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于650nm波長(cháng)處測定各管中溶液的吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，對水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效。
缺點(diǎn)：①費時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數蛋白質(zhì)在280nm波長(cháng)處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。
取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長(cháng)處進(jìn)行比色，記錄吸光度值。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。?
缺點(diǎn)：①測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，專(zhuān)一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì )出現較大的干擾。
5、考馬斯亮藍法
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質(zhì)結合后，其對可見(jiàn)光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。
在考馬斯亮藍 G-250 過(guò)量且濃度恒定的情況下，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時(shí)，就會(huì )有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關(guān)系。
一般情況，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線(xiàn)性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來(lái)測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，測定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類(lèi)、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò )合劑的影響，適合大量樣品的測定。
缺點(diǎn)：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差。
參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)測定
3.蛋白質(zhì)的檢驗方法
蛋白質(zhì)測定方法： 測定蛋白質(zhì)的方法可分為兩大類(lèi)： 一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質(zhì)含量 ； 另一類(lèi)是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團 以及芳香基團等測定蛋白質(zhì)含量。
（1） 凱氏定氮法： 是通過(guò)測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質(zhì)系數而求出蛋白質(zhì)的含量，由于樣品中含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，故此法的結果稱(chēng)為粗蛋白質(zhì)含量。（是食品上蛋白質(zhì)含量測定最常用的方法） （2） 雙縮脲法 （3） 染料結合法 （4） 酚試劑法：方法簡(jiǎn)便快速，故多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。
（5） 紫外分光光度法-近紅外光譜法。
4.蛋白質(zhì)定量測定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時(shí)
8~10小時(shí) 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時(shí)太長(cháng)
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò )合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時(shí)間長(cháng)；操作要嚴格計時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
