病毒的分離培養(yǎng)方法(病毒的培養(yǎng)方法)
1.病毒的培養(yǎng)方法有哪些
病毒的培養(yǎng)方法： （1）動(dòng)物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進(jìn)入易感動(dòng)物的體內(nèi)后可大量增殖，并使動(dòng)物產(chǎn)生特定的反應(yīng)。
優(yōu)點(diǎn)：操作方面易行。缺點(diǎn)：受機(jī)體免疫力的影響，常需要用無菌動(dòng)物。
運(yùn)用：分離、增殖病毒，疫苗效力試驗(yàn)，疫苗和抗血清的生產(chǎn)。 （2）雞胚培養(yǎng)：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內(nèi)，羊膜腔，尿囊腔等部位。
病毒生長的標(biāo)志為雞胚死亡、畸型和出血。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。
（3）組織培養(yǎng)：在離體活細(xì)胞上培養(yǎng)病毒的方法 1）組織塊培養(yǎng)：取組織片（如一段胎兒氣管或一小塊鼻黏膜）進(jìn)行培養(yǎng)。 2）細(xì)胞培養(yǎng)：病毒感染細(xì)胞后，大多數(shù)引起細(xì)胞病變，稱為病毒的致細(xì)胞病變作用。
表現(xiàn)為細(xì)胞變形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒化，核濃縮、核裂解等。
2.目前病毒分離培養(yǎng)的主要方法是哪一種
1.動(dòng)物接種
這是最原始的病毒培養(yǎng)方法。常用的動(dòng)物有小鼠、大鼠、豚鼠百、兔和猴等，接種的途徑有鼻內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腦內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈等。根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位。
2.雞胚接種雞胚對多種病度毒敏感。根據(jù)病毒種類不同，可將標(biāo)本接種于雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜上。
3.組織培養(yǎng)
將離體活組織塊或分散的活細(xì)胞加回以培養(yǎng)，統(tǒng)稱為組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)法有三種基本類型：器官培養(yǎng)、移植培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)最常答用于培養(yǎng)病毒，根據(jù)細(xì)胞的來源，染色體特性及傳代次數(shù)又可分為下列類型：原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)，二倍體細(xì)胞株和傳代細(xì)胞系。
3.病毒分離培養(yǎng)的方法是什么
1）病毒分離培養(yǎng)：用人成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)，但通常需要3~14天方可觀察到CPE，一般需觀察28天，病變組織標(biāo)本涂片的常規(guī)HE染色，也可直接觀察CPE和核內(nèi)嗜堿性包含體。
2）抗原檢測：應(yīng)用特異性抗體作免疫熒光，直接檢測白細(xì)胞、活檢組織、組織切片、支氣管肺泡洗液等臨床標(biāo)本中的CMV抗原。3）病毒核酸檢測：應(yīng)用PCR與核酸雜交等方法，可快速、敏感地檢測CMV特異性的DNA片段。
4）抗體檢測：特異性IgG類抗體需測雙份血清以作臨床診斷，同時(shí)了解人群感染狀況；IgM抗體只需檢測單份血清以確定活動(dòng)性CMV感染。
4.病毒的培養(yǎng)方法有哪些
病毒的培養(yǎng)方法有動(dòng)物接種、雞胚培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)。
1、動(dòng)物接種：病毒經(jīng)注射、口服等途徑進(jìn)入易感動(dòng)物的體內(nèi)后可大量增殖，并使動(dòng)物產(chǎn)生特定的反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：操作方面易行。
缺點(diǎn)：受機(jī)體免疫力的影響，常需要用無菌動(dòng)物。疫苗和抗血清的生產(chǎn)。
2、雞胚培養(yǎng)：一般用9-12日齡的雞胚，分別接種于卵黃囊內(nèi)，羊膜腔，尿囊腔等部位。用于病毒分離與疫苗生產(chǎn)。
3、組織培養(yǎng)：在離體活細(xì)胞上培養(yǎng)病毒的方法，組織塊培養(yǎng)：取組織片進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)：病毒感染細(xì)胞后，大多數(shù)引起細(xì)胞病變，稱為病毒的致細(xì)胞病變作用。
表現(xiàn)為細(xì)胞變形，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆?；?，核濃縮、核裂解等。4、采用該病毒所寄生的細(xì)胞的全素培養(yǎng)基來培養(yǎng)該細(xì)胞，培養(yǎng)一段時(shí)間后放進(jìn)特定的病毒就可以培養(yǎng)了，注意，若細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基要加入血清。
5.病毒的提取,培養(yǎng),及其觀察的方法
一）、莖尖脫毒 1、莖尖脫毒的依據(jù)。
病毒在植物體內(nèi)分布是不均一的，越接近生長點(diǎn)約（0.1-1mm區(qū)域），病毒濃度越稀，因此有可能采用小的莖尖離體培養(yǎng)而脫除植物病毒。 2、莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒的技術(shù)關(guān)鍵 （1）、被脫毒植物攜帶病毒的診斷及其在體內(nèi)的分布 再脫毒之前，應(yīng)了解植物攜帶何種病毒，病毒在體內(nèi)的分布位置，以確定培養(yǎng)莖尖的大小 （2）、母體植株的選擇和預(yù)處理 母體的選擇： 欲脫毒材料的品種典型性：關(guān)系到脫毒以后的脫毒苗是否保持原品種的特征特性 植體健康程度選擇：應(yīng)選感病輕、帶毒量少的健康植株作為脫毒的外植體材料，這樣更容易獲得脫毒株。
外植體預(yù)處理： （3）、莖尖的剝離 在剝?nèi)∏o尖時(shí)，把莖芽置于解剖鏡下（8~40倍），一只手用鑷子將其按住，另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進(jìn)行消毒。但要注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進(jìn)行冷卻。
當(dāng)一個(gè)閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為了提高成活率，可帶1-2枚幼葉，然后將其接到培養(yǎng)基上。接種時(shí)確保微莖尖不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。
剝離莖尖時(shí)，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露的時(shí)間應(yīng)當(dāng)越短越好，以防莖尖變干。可在一個(gè)襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，有助于防止莖尖變干。
將接種好的莖尖置于25℃左右的溫度下。每天以16小時(shí) 2000-3000lx的光照條件下培養(yǎng)。
由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時(shí)間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。
繼代培養(yǎng)得到足夠的檢測苗、進(jìn)行病毒檢測。 （4）、脫毒效果檢測 A 指示植物鑒定（indicator test plants） 所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。
每種病毒都有自己敏感的植物，例如： 馬鈴薯病毒的敏感植物有千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼佗羅 大麗花病毒的敏感植物為：矮牽牛、黃瓜、莧色蘺 菊花病毒：矮牽牛、豇豆 指示植物鑒定病毒的方法 a.摩擦接種法： 取培養(yǎng)植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0），磨成勻獎(jiǎng)，將其涂抹在指示植株葉片上，在指示植物的葉片撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細(xì)胞而又不損傷葉片。5分鐘后用清水清洗葉面。
將指示植株放于防蚜蟲網(wǎng)罩的溫室內(nèi)。然后視其病斑的有無，來判斷是否脫除了病毒。
例如：植物液接種后如使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內(nèi)具有馬鈴薯X病毒 b、嫁接法 有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進(jìn)行傳播的。這種病毒的鑒定，需將培養(yǎng)植株的芽嫁接在敏感植物上，根據(jù)敏感植株的病癥來判斷是否脫除了病毒 B 血清鑒定（serologic test） 試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）。
a、試管沉淀反應(yīng) 在抗原-抗體最適比例的條件下，觀察有無沉淀的產(chǎn)生來確定被測植株是否帶病毒。試管沉淀反應(yīng)操作簡單，需注意的問題： ①、葉綠體的自發(fā)凝聚 可用磷酸緩沖液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，pH 保持在6.5-8.5） ② 、抗原抗體的比例要適當(dāng)，當(dāng)抗原過量時(shí)回抑制沉淀的形成 b、免疫雙擴(kuò)散 在半固體凝膠中測定在其中擴(kuò)散的抗原和抗體間的沉淀反應(yīng)的方法。
與沉淀法比較起來有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是節(jié)約血清，二是汁液不用特殊處理。 步驟： ①倒膠，一般厚2mm ②打孔，多打成梅花型 ③加樣，加血清和汁液。
一般加樣后在37℃恒溫過夜，即可進(jìn)行結(jié)果觀察。有擴(kuò)散沉淀的即為帶毒株，沒有則為不帶毒株 c、酶連免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA） 它是將抗原、抗體的免役反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合起來的一種綜合性技術(shù)。
即通過化學(xué)的方法將酶與抗體或抗原結(jié)合起來，形成酶標(biāo)記物。然后將它與相應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物。
結(jié)合在免疫復(fù)合物的酶，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，催化無色底物生成有色底物，通過比色計(jì)可以準(zhǔn)確測定。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，測定快速，每次可以同時(shí)測定多個(gè)樣品。
C 電鏡檢查法 采用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可以進(jìn)一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu)，這些特征相當(dāng)穩(wěn)定，因此電鏡檢查法即準(zhǔn)確又有效，但需要有一定的設(shè)備和技術(shù)。 D 分子檢測法 例如RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reation)將待測的樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒基因的表達(dá) n 脫毒苗的離體保存與繁殖：一般是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，一般每月繼代一次，可以在培養(yǎng)基中加入生長延緩劑，如B9和矮壯劑可2-3個(gè)月繼代一次，也可放到液氮或4℃冰箱中保存 n 建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系：如果試管苗生產(chǎn)成本過高或移栽困難，可將試管苗選擇種植在一定的控制區(qū)域，從繁殖技術(shù)和環(huán)境隔離上保證較高水平，使得繁殖的種苗能有效的防止病毒的再侵染 （5） 影響脫毒效果的因素 n 母體材料病毒侵染的程度：單一病毒。
