石蠟制片(石蠟切片法的詳細過(guò)程和注意事項)
1.石蠟切片法的詳細過(guò)程 和注意事項
在顯微鏡下觀(guān)察植物體內部的細微結構之前，必須根據植物材料的特性，采用不同的方法，對植物材料進(jìn)行處理，把材料制成透明的玻片標本.根據材料的性質(zhì)和制作法的不同，常用的植物顯微制片技術(shù)可以分為切片法與非切片法兩大類(lèi)，前者常用的有徒手切片法，冰凍切片法，火棉膠切片法，石蠟切片法，冷凍切片法等，其中以石蠟切片法最為常用.后者包括整體封藏法，涂布法，壓片法等.石蠟切片法 石蠟切片法是以石蠟作包埋劑，用旋轉切片機將材料切成薄片，經(jīng)一系列處理制成永久制片的方法.在研究植物的細胞，組織，胚胎以及形態(tài)等方面石蠟切片法是最理想的制片方法. 石蠟切片法的一般流程為：取材→固定→抽氣→洗滌→脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→粘片→染色→封片.取材 用鋒利的刀片切取新鮮的植物材料，選定適宜的材料，立即固定.取材的注意事項如下：（1）取材料要新鮮.動(dòng)作要迅速，以免擠壓損壞組織；取病理材料時(shí)，應設置對照材料.（2）所取材料大小要適當：根和莖一般直徑≤5mm，切取成5-10mm小段；葉片一般取過(guò)中脈處，切成2-5mm寬，5-8mm長(cháng).在切材料時(shí)，必須注意刀片與中軸成直角，兩切面平行，否則制成的切片細胞是斜的. 雌，雄蕊一般不需分割.（3）取材時(shí)間可根據切片要求有所區別.如：在進(jìn)行植物發(fā)育的研究過(guò)程時(shí)，需要找到細胞分裂相，一般在晴天的早晨9:00-10:00時(shí)取材，此時(shí)植物細胞分裂活動(dòng)較明顯.（4）取材不易過(guò)老，否則制片有難度（過(guò)老的材料須在滑走切片機上進(jìn)行）；對縱切的材料適當多取材，如根尖，莖尖等，因為切到材料正中的概率較低.（二）固定 將已切好的材料盡快地浸入相當于材料10-15倍體積的固定液中.借助固定液的作用，使細胞的新陳代謝瞬時(shí)停止，并保持細胞或組織的形態(tài)構造及其內含物的狀態(tài)不發(fā)生變化.從而達到使組織變硬從而便于切片，增強內含物的折光度，令細胞易于著(zhù)色的目的，同時(shí)具有防腐作用.以新鮮配制固定液效果較好.固定的時(shí)間依材料的種類(lèi)，性質(zhì)，大小等而定.材料固定完畢，保存于加蓋的容器內，貼上標簽.良好的固定劑，應是穿透力強，使細胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強折光率，并且不妨礙染色. 常用固定液：簡(jiǎn)單固定液 以一種化學(xué)藥品配制的固定液.⑴ 乙醇 為凝固型固定劑.常用無(wú)水乙醇或95%乙醇.⑵ 甲醛 為非凝固性固定劑.具強烈刺激性氣味.純凈的甲醛為無(wú)色透明液體.固定用的濃度為4%-10%.⑶ 醋酸 為凝固型固定劑.為無(wú)色透明的液體，刺激性極強，低溫下凝結成冰，故又名冰醋酸.2. 混合固定液：由幾種試劑，適量配制而成.混合遵循原則：① 優(yōu)缺點(diǎn)互補；② 膨脹與收縮相互平衡；③ 強氧化劑與還原劑應分別配置.常用混合固定液有下列幾種：⑴ FAA 固定液（福爾馬林-冰醋酸-乙醇） 廣泛適用于根，莖，葉，花藥，子房的組織切片，所以又稱(chēng)為萬(wàn)能固定液.一般固定時(shí)間不低于24 h.該固定液優(yōu)點(diǎn)是在較低溫度下（10℃左右）適用于材料的長(cháng)期保存，可兼作保存液.并且固定的材料，不妨礙染色，但用于細胞學(xué)上的固定效果較差.⑵ 納瓦興（Navaschjn's）固定液 1912年首創(chuàng ).適用于細胞學(xué)與組織學(xué)研究的切片觀(guān)察.但滲透慢，不能長(cháng)期保存；主要用于顯示分裂相.（三）抽氣 植物材料內部多由于含有空氣，導致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽氣.以便讓固定液有效透入材料組織中，并排除材料內氣泡的干擾.一般抽氣時(shí)間為20-30 min.抽過(guò)氣的材料在停止抽氣，應沉入底部.（四）洗滌 固定液中的成分有可能會(huì )妨礙染色或發(fā)生沉淀或結晶，影響觀(guān)察；有的還會(huì )繼續作用，使材料變質(zhì)等.因此，在使用材料時(shí)，需根據固定液的種類(lèi)，用水，緩沖液或70%乙醇洗去滲入細胞內部的固定液.如：用FAA固定的材料在脫水時(shí)用70%乙醇反復洗滌數次.如用水洗滌，可將材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用紗布將管口扎緊，置于水槽內，進(jìn)行流水沖洗.流水沖洗時(shí)間一般為12-24 h. （五）脫水 材料經(jīng)洗滌后含有部分水分，會(huì )使材料分解.而且透明劑與水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期處理.因此需用脫水劑逐漸除去材料中的水分，以便讓石蠟滲透進(jìn)細胞.所以，脫水是制片的關(guān)鍵環(huán)節.脫水劑要求能與水混合，而且能與其他有機溶劑互相替代.脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分；在更換高一級的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料，以免損壞材料.（六）透明 透明劑要具有既能與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質(zhì)，可以將材料中的脫水劑置換出來(lái)，使石蠟能順利進(jìn)入材料中.二甲苯是目前應用最廣的透明劑，作用迅速，但易使材料變脆..（七）浸蠟 是指逐步清除材料中的透明劑，以使石蠟充分滲透于材料內部的過(guò)程.這樣，材料的各部分都能保持原來(lái)的結構與位置，切片不致發(fā)生破裂或其他變形.浸蠟是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，常用的正丁醇.每次浸蠟的時(shí)間，視材料大小而調節.（八）包埋 材料經(jīng)過(guò)足夠時(shí)間的浸蠟后，需包入蠟塊，以備切片.操作方法：根據切片材料大小，確定所需紙盒的尺寸，用表面光滑的磅紙預先疊好紙盒.（九）切片 即將包埋好的材料塊用切片機切成所需厚度的切片帶.（十）貼片 是。
2.做石蠟包埋切片的流程有哪些,需要注意什么呢
過(guò)程大致如下： ⑴固定：生物標本脫離機體或培養環(huán)境，細胞會(huì )發(fā)生自溶，腐敗分解。
因此，需用固定劑處理，使蛋白質(zhì)凝固停止瀕死或死后變化。凡供永久保存的標本都需經(jīng)固定處理。
常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質(zhì)凝固。還有由幾種試劑配成的固定液，例如Carnoy固定液，由無(wú)水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強，不含水分，可避免水溶性物質(zhì)如糖原等在固定過(guò)程中損失。
⑵脫水：是將組織細胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），濃度遞升到 100%。
此過(guò)程還使組織塊進(jìn)一步硬化。 ⑶透明：是用既能溶于純酒精又能融解石蠟的有機溶劑，將組織中的酒精取代，以便石蠟浸入。
通常用二甲苯（xylene）為透明劑。 ⑷浸蠟：在溫箱內進(jìn)行。
已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組織，作為支持介質(zhì)。 ⑸包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包埋。
⑹切片：用切片機。常用的切片機有輪轉式、平推式的。
用輪轉式的易于切出連續切片。切片厚度隨制片目的而調整。
教學(xué)標本厚度多是5~6μm。 ⑺貼片烤干：石蠟切片在溫水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色處理。
染色后用樹(shù)膠、蓋坡片封固，可永久保存。
3.石蠟治療有什么注意事項?
石蠟治療的注意事項如下：（1）石蠟治療前使治療區的皮膚保持清潔，如有污穢、汗液應除去，毛發(fā)較多時(shí)可剃去，有毛發(fā)處應涂凡士林。
（2）醫用蠟中不應含有水分，以免引起燙傷。若在加熱熔化時(shí)出現啪啪聲和泡沫，則表示有水分。
脫水的方法是將蠟加熱至100?ll0°C，同時(shí)不斷攪拌，泡沫及啪啪聲即消失。 （3）石蠟加熱必須采用隔水加熱的方法，以免燒焦或燃燒。
注意防火、防燒、燙傷。蠟療過(guò)程中防止發(fā)生燙傷。
為防止燙傷，應注意在使用相應蠟型時(shí)不能用力擠壓，防止中間未凝固的蠟液流出燙傷皮膚；應準確掌握蠟溫，同時(shí)根據患者對溫度耐受的個(gè)體差異而調節蠟溫，不能強求溫度一致，隨時(shí)聽(tīng)取患者的主訴，感覺(jué)太熱時(shí)應即松開(kāi)外面固定的繃帶，待患者能耐受時(shí)再重新固定；所用石蠟中應不含有水分；若皮膚上有破損，可在上面蓋一層凡士林紗布后再進(jìn)行蠟療。 （4）其次，為保證蠟療的療效，制作的相應蠟型應超過(guò)所敷患處的范圍，且讓制作的相應蠟型與患處盡量緊貼，塑好形，不留空隙，這樣易于保溫。
4.病理學(xué)檢驗技術(shù)做快速切片的方法和注意事項?
冰凍切片 是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。
其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細胞表面抗原更應 采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。
冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。 一般認為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對組織結構損害較大，在含水量較多的組織中上述現象更易發(fā)生。
冰晶的大小與其生長(cháng)速率成正比，而與成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的數量愈多則愈小，對組織結構影響愈嚴重。因此，應盡量降低冰晶的數量。
Fish認為冰凍開(kāi)始時(shí)，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C， 從-30。
C降至-43。C之間，成核率急劇增加達1018，然后再減慢。
基于上述理論可采取以下措施減少冰晶的形成。 （1）速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。
C43。C的時(shí)間，減少冰晶的形成。
其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達-70℃C，用一小燒杯（50-100ml）內裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內，至異戊烷溫度達-70℃時(shí)即可使用。 將組織（大小為1cm*0。
8cm*0。5cm）投入異戊烷內速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內以備切片，或置-80℃低溫冰箱內貯存。
②液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，當盒底部接觸液氮時(shí) 即開(kāi)始氣化沸騰，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。 取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存備用，或置入恒冷箱切片機冰凍切片。
（2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1~3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。 影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。
目前冰凍切片機有兩類(lèi)： ①恒慢冰凍切片機（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機，型號很多，但其基本結構是將切片機置于-30℃C低溫密閉室內，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續切薄片至2-4μm，完全能滿(mǎn)足免疫組織化學(xué)標記要求。 切片時(shí)，低溫室內溫度以-15℃~18℃為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。
②開(kāi)放式冰凍切片機：包括半導體致冷切片機和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機。切片時(shí)暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度 大，在高溫季節 ，切片更加困難，且切片厚8~15μm，不易連續切片，但其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉，國內有生產(chǎn)。
冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內， 或進(jìn)行短暫預固定后貯存冰箱保存 石蠟切片 其優(yōu)點(diǎn)是組織結構保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能切連續薄片，組織結構清晰，抗原定位準確。 用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規制片略有不同：①脫水、透明等過(guò)程應在4℃。
C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應限于2cm*1。
5cm*0。2cm，使組織充分脫水、透明、浸蠟。
③浸蠟、包埋過(guò)程中，石蠟應保持在60℃以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋）。 以上全過(guò)程為18-24h，也可在室溫內使用自動(dòng)脫水機代替。
如組織塊小， 直徑小于0。5cm，可用快速石蠟包埋切片，全過(guò)程只需4h左右。
石蠟切片為常規制片技術(shù)，切片機多為輪轉式，切片厚度2~7μm，應用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。 由于甲醛固定、有機熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。
有人報告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應入37℃恒溫箱過(guò)夜，這樣烤片可減少染色中脫片現象。
切片如需長(cháng)期貯存，可存放于4℃冰箱內備用。 石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)酒精、二甲苯等有機溶劑處理，組織內抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存組織內可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。
該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍干燥機（Freezing dryer）在真空、低溫條件下排除組織內水分 ，然后用甲醛蒸氣固定干燥的組織，最后將組織浸蠟、包埋、切片。此法可用于免疫熒光標記、免疫酶標記及放射自顯影。
振動(dòng)切片 用振動(dòng)切片機（Vibratotme），可以把新鮮組織（不固定不冰凍）切成厚片20~100μm，以漂浮法在反應板進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，然后在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽(yáng)性部位，修整組織進(jìn)行后固定，最后按電鏡樣品制備、脫水、包埋、超薄切片、染色觀(guān)察等。 組織不冰凍，無(wú)冰晶形成和組織抗原破壞，在免疫組化染色前避免了組織脫水、透明、包埋等步驟對抗原的損害，能較好地保留組織內脂溶性物質(zhì)和細胞膜抗原，主要用于顯示神經(jīng)系統抗原分布研究。
這種包埋前染色，尤其實(shí)用于免疫電鏡觀(guān)察。 塑料切片 塑料包埋切片常用包埋劑有甲基丙烯酸鹽類(lèi)（Glycol 。
5.固體石蠟如何分等級
石蠟是石油加工產(chǎn)品的一種。
固體烷烴的混合物。無(wú)臭無(wú)味、白色或淡黃色固體。
由天然石油和人造的含蠟餾分用冷榨或溶劑脫蠟、發(fā)汗等方法制得。用于制高級脂肪酸、高級醇、火柴、蠟燭、防水劑、軟膏、電絕緣材料等。
[1] 石蠟[2]是礦物蠟的一種，也是石油蠟的一種；它是從原油蒸餾所得的潤滑油餾分經(jīng)溶劑精制、溶劑脫蠟或經(jīng)蠟冷凍結晶、壓榨脫蠟制得蠟膏，再經(jīng)溶劑脫油、精制而得的片狀或針狀結晶。又稱(chēng)晶形蠟，碳原子數約為18~ 30的烴類(lèi)混合物，主要組分為直鏈烷烴（約為80%~95%），還有少量帶個(gè)別支鏈的烷烴和帶長(cháng)側鏈的單環(huán)環(huán)烷烴（兩者合計含量20%以下）。
主要質(zhì)量指標為熔點(diǎn)和含油量，前者表示耐溫能力，后者表示純度。其中以前二者用途較廣，主要用作食品及其他商品（如蠟紙、蠟筆、蠟燭、復寫(xiě)紙）的組分及包裝材料，烘烤容器的涂敷料、化妝品原料，用于水果保鮮、提高橡膠抗老化性和增加柔韌性、電器元件絕緣、精密鑄造等方面，也可用于氧化生成合成脂肪酸。
注：石蠟是非晶體！ 2化學(xué)性質(zhì)編輯 化學(xué)中，石蠟是固態(tài)高級烷烴混合物的俗名，分子式為CnH2n+2，其中n=20-40。石蠟不與常見(jiàn)的化學(xué)試劑反應，但可以燃燒。
3物理性質(zhì)編輯 石蠟又稱(chēng)晶形蠟，通常是白色、無(wú)色無(wú)味的蠟狀固體，在47°C-64°C熔化，密度約0.9g/cm3。它不溶于水，但可溶于醚、苯和某些酯中。
純石蠟是很好的絕緣體，其電阻率為1013-1017歐姆·米[2]，比除某些塑料（尤其是特富龍）外的大多數材料都要高。石蠟也是很好的儲熱材料，其比熱容為2.14–2.9J·g–1·K–1，熔化熱為200–220J·g–1。
石蠟是蠟燭的主要成分。 4元素符號編輯 關(guān)于石蠟的化學(xué)元素符號有幾種說(shuō)法，一種說(shuō)法是石蠟的的主要成分是C（碳）、H（氫）兩種元素的物質(zhì)混合而成。
（可能含有氧元素，但這不主要）其化學(xué)元素符號為CxHy。另種說(shuō)法是石蠟是幾種高級烷烴的混合物，主要是正二十二烷（C22H46）和正二十八烷（C28H58），含碳元素約85%，含氫元素約14%.沒(méi)有單一的化學(xué)元素符號。
5性能指標編輯 石蠟的主要性能指標是熔點(diǎn)、含油量和安定性。[3] 熔點(diǎn) 石 蠟是烴類(lèi)的混合物，因此它并不像純化合物那樣具有嚴格的熔點(diǎn)。
所謂石蠟的熔點(diǎn)、是指在規定的條件下，冷卻熔化了的石蠟試樣，當冷卻曲線(xiàn)上第一次出現停滯期 的溫度。各種蠟制品都對石蠟要求有良好的耐溫性能，即在特定溫度r.不熔化或軟化變形。
按照使用條件、使用的地區和季節以及使用環(huán)境的差異，要求商品石蠟 具有一系列不同的熔點(diǎn)。 影響石蠟熔點(diǎn)的主要因素是所選用原料餾分的輕重，從較重餾分脫出的石蠟的熔點(diǎn)較高。
此外，含油量對石蠟的熔點(diǎn)也有很大的影響，石蠟中含油越多，則其熔點(diǎn)就越低。 含油量 含油量是指石蠟中所含低熔點(diǎn)烴類(lèi)的量。
含油量過(guò)高會(huì )影響石蠟的色度和儲存的安定性，還會(huì )使它的硬度降低。所以從減壓餾分中脫出的含油蠟膏，還需用發(fā)汗法或溶劑法進(jìn)行脫油，以降低其含油量。
但大部分石蠟制品中需要含有少量的油，這對改善制品的光澤和脫模性能是有利的。 安定性 石蠟制品在造型或涂敷過(guò)程中，長(cháng)期處于熱熔狀態(tài)，并與空氣接觸，假如安定性不好，就容易氧化變質(zhì)、顏色變深，甚至發(fā)出臭味。
此外，使用時(shí)處于光照條件下石蠟也會(huì )變黃。因此，要求石蠟具有良好的熱安定性、氧化安定性和光安定性。
影響石蠟安定性的上要因素是其所含有的微量的非烴化合物和稠環(huán)芳烴。為提高石蠟的安定性，就需要對石蠟進(jìn)行深度精制，以脫除這些雜質(zhì)。
6石蠟分類(lèi)編輯 根據加工精制程度不同，可分為全精煉石蠟、半精煉石蠟和粗石蠟3種。每類(lèi)蠟又按熔點(diǎn)，一般每隔2℃，分成不同的品種，如52,54,56,58等牌號。
粗石蠟含油量較高，主要用于制造火柴、纖維板、篷帆布等。 石蠟 主要成分為直鏈烷烴，并含有少量的支鏈烷烴。
直鏈烷烴含量從75%到接近100%不等。每一特定的品種大約是由8-15個(gè)不同碳數的烷烴所組成。
石蠟是一種白色團體，溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石腦油等一類(lèi)非極性溶劑，不溶于如水和甲醇等極性溶劑。 微晶石蠟 微晶石蠟主要是出文鏈烴、環(huán)烷烴和一些直鏈烴組成，分子量范圍大約是500-1000。
這是一種比較細小的晶體，溶于非極性溶劑，不溶于極性格劑。 液體石蠟 液體石蠟的種類(lèi)很多，其潤滑效果也各不相同。
在擠出加工中初期潤滑效果良好，熱穩定性也較好。但因相溶性差，用量過(guò)多時(shí)制品易發(fā)粘。
聚乙烯蠟 （簡(jiǎn)稱(chēng)ACPE） 聚乙烯蠟指分子量為1500-25000的低分子量聚乙烯或部分氧化的低分子量聚乙烯。其呈顆粒狀、白色粉末、塊狀以及乳白色蠟狀。
具有優(yōu)良的流動(dòng)性、電性能、脫模性。 半精煉石蠟 為顆粒狀白色固體.其相對密度隨熔點(diǎn)的上升而增加.產(chǎn)品化學(xué)穩定性好，含油量適中，具有良好的防潮和絕緣性能，可塑性好.半精煉石蠟生產(chǎn)的蠟燭火焰集中，無(wú)煙，不流淚. 用于蠟燭，蠟筆，蠟紙，一般電訊器材以及短路及輕工，化工原料。
7切片制作編輯 石 蠟切片以石蠟制作的切片，可以制成極薄的切片。一般的切片厚度要求在4—6微米。
而石蠟切片不但可以達到這個(gè)要求，甚至可以切得更薄到2微米以。
