制作平板培養(yǎng)基的(配制培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題)
1.配制培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題
1、培養(yǎng)基配方的選定
同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會(huì)有某些差別。因此，除所用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一般均應(yīng)盡量收集有關(guān)資料，加以比較核對(duì)，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。
2、培養(yǎng)基的制備記錄
每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，和各種成份的牌號(hào)，最終pH值、消毒的溫度和時(shí)間制備的日期和制備者等，記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄保存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、以防發(fā)生混亂。
3、培養(yǎng)基成分的稱取
培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯(cuò)亂，最好一次完成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記號(hào)，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。
4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化
培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長(zhǎng)。最好使用不銹鋼萵加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流動(dòng)蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時(shí)、可先用溫水加熱并隨時(shí)擾動(dòng)、以防焦化、如發(fā)現(xiàn)有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。
5、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正
因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會(huì)有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2，而腸浸液pH卻會(huì)有顯著的升高。因此，對(duì)這個(gè)步驟，操作者應(yīng)隨時(shí)注意探索經(jīng)驗(yàn)、以期能掌握培養(yǎng)基的最終PH，保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。
6、培養(yǎng)基的過濾澄清
液體培養(yǎng)基必須絕對(duì)澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透明無顯著沉淀，因此 ，須要采用過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項(xiàng)要求。一般液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以避免因液壓不均勻而引起濾紙破裂。
瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時(shí)、則須先用絨布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用蛋清澄清法。即將冷卻至55~60°C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶?jī)?nèi)，裝入量不得超過燒瓶容量的1/2，每1000ml培養(yǎng)基加入1~2個(gè)雞蛋的蛋白，強(qiáng)力振搖3~5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121°C加熱20分鐘、取出趁熱以絨布過濾即可。
7、培養(yǎng)基的分裝
培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一般多有用螺旋蓋者）。分裝時(shí)最好能使用半自動(dòng)或電動(dòng)的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時(shí)，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌，以為測(cè)定該批培養(yǎng)基最終pH之用。
8、培養(yǎng)基的滅菌
一般培養(yǎng)基可采用121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。
某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入于經(jīng)冷卻約50°C左右的培養(yǎng)基中。
瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時(shí)，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。
9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測(cè)試
每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測(cè)定其最終pH。
將全部培養(yǎng)基放入36±1°C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，即棄去。
用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24~48小時(shí)，如無菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好。應(yīng)追查原因并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。
10、培養(yǎng)基的保存
培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于普通冰箱內(nèi)。放置時(shí)間不宜超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批培養(yǎng)基制備記錄副頁(yè)或明顯標(biāo)簽。
2.培養(yǎng)基的制作及無菌操作技術(shù)常見的注意事項(xiàng)
培養(yǎng)基的制作注意事項(xiàng)：
1 注意營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度比和C/N比
2 控制pH條件
3 原料來源的選擇
4 滅菌處理
無菌操作注意事項(xiàng)：
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %
ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每
次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間
污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間
隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦
拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操
作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，
盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒
感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過程
中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳
針頭之傷害等。
5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：
5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。
5.3. 無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300
小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水
3.配置培養(yǎng)基的基本步驟有哪些
培養(yǎng)基的配置應(yīng)該注意的幾大步驟：1、常用玻璃儀器的準(zhǔn)備制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈，晾干后備用。
（1）平皿用紙或布包好，或裝在金屬盒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干，備用。 （2）試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好，再用布或報(bào)紙包扎好，121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干，備用。
（3）吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端（防止污染物吸出，或橡皮帽內(nèi)的氣體污染），然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi)，于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干，備用。其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理，也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后，備用。
2、培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存 （1）溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。
在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將蒸餾水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10—15min，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過長(zhǎng)，溫度不宜過高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。 （2）校正酸堿度（調(diào)節(jié)pH）：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H。
因此測(cè)定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一，測(cè)定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2℃。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。
當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時(shí)，宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會(huì)比滅菌前的pH升高或降低，一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會(huì)比最終pH調(diào)高0.2左右，滅菌后基本合適。
因此對(duì)培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進(jìn)行測(cè)定，并記下每次pH的測(cè)定結(jié)果，有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對(duì)滅菌程序的耐受性，從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH，用時(shí)也必須再驗(yàn)證。
測(cè)定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH不符，可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過濾，使培養(yǎng)基澄清。
（ 更多質(zhì)量檢測(cè)、分析測(cè)試、化學(xué)計(jì)量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相關(guān)技術(shù)資料請(qǐng)參考中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) ） (3)培養(yǎng)基的分裝：大批量配制時(shí)使用的自動(dòng)分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn)。每次使用前后，均要對(duì)分配器的管道系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，在分裝無菌培養(yǎng)基前，則要采用無菌硅膠管。
固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。 平皿：傾注平皿，應(yīng)在無菌室中放置3—4h，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min。
讓水蒸汽自然蒸發(fā)。 斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積1/5，滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去，以避免污染。
高層斜面：制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。 分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時(shí)密封后必須在配制當(dāng)天（2h內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理。
液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。 培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。
普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min，但容器和裝量較大時(shí)，應(yīng)延長(zhǎng)至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。
含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動(dòng)蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min，連續(xù)3d，間歇滅菌。血清或組織液，采用低熱56—58水浴1h，連續(xù)5—6d滅菌，一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等，可用細(xì)菌過濾器，過濾除菌。
高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全部殺滅微生物。以上的滅菌時(shí)間和溫度要經(jīng)過驗(yàn)證確認(rèn)，如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時(shí)宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。
通過無菌技術(shù)為測(cè)試制備的每一批培養(yǎng)基其PH在放冷至室溫（25°）后，都應(yīng)測(cè)定。一個(gè)扁平的pH計(jì)用于培養(yǎng)基表面pH值的測(cè)定，浸入式的pH計(jì)用于液體的測(cè)定。
各供應(yīng)商提供的培養(yǎng)基的pH應(yīng)該在規(guī)定的±0.2的范圍內(nèi)，除非通過驗(yàn)證得到更寬的范圍 注意：按配方計(jì)算培養(yǎng)基中各種成分的用量→稱量，（一般動(dòng)作要迅速一些，因?yàn)槠渲锌赡苡行┏煞秩菀孜保芑▽⒎Q好的各種成分溶解在水中，如果是固體培養(yǎng)基，需要使用凝固劑，如瓊脂等，熔化時(shí)，注意攪拌，防止糊底）→調(diào)pH→滅菌（高壓蒸汽滅菌）→倒平板 1）確認(rèn)培養(yǎng)基的成分，并精確稱量；2）加入各個(gè)成分的順序；3）準(zhǔn)確調(diào)pH;4） 適當(dāng)?shù)臏缇椒ǎ?）無菌條件下分裝.。
