目視比色法(比色法操作的注意事項是什么?)
1.比色法操作的注意事項是什么?
噻唑藍（MTT）比色法操作注意事項
噻唑藍（MTT）：四唑鹽
1. 原理：
MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長(cháng)的方法.活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物，并沉淀在細胞中，而死細胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與活細胞數成正比。
2. 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速、靈敏、經(jīng)濟
3. 缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì )對實(shí)驗結果的準確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實(shí)驗者也有損害。
4. 應用：新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實(shí)驗等
5. MTT主要有兩個(gè)用途
1）藥物（也包括其他處理方式如放射線(xiàn)照射）對體外培養的細胞毒性的測定；
2） 細胞增殖及細胞活性測定。
6. 比色法操作注意事項
1） 選擇適當的細胞接種濃度，保證細胞培養結束時(shí)濃度不至于過(guò)滿(mǎn)。
2） 種板技術(shù)：均勻。
3） 實(shí)驗時(shí)應設置調零孔，溶媒孔，加藥孔。
調零孔：培養基、MTT、DMSO。（無(wú)細胞）
溶媒孔：培養液、MTT、DMSO、細胞、溶酶。
加藥孔：培養液、MTT、DMSO、細胞、不同濃度的藥物。
（一般5-7個(gè)梯度，設3-5個(gè)復孔）
4）避免血清干擾：一般選小于10%胎牛血清的培養液進(jìn)行。
5）邊緣效應：周邊孔加入PBS。
6)MTT的配置： MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液。4℃下避光保存2周。
7）孔板的重復利用（1.做完MTT后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個(gè)小時(shí)（小心最好讓洗衣粉先化開(kāi)）。2.用自來(lái)水沖凈洗衣粉水，倒扣晾
干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過(guò)夜泡洗液（六小時(shí)以上即可）后自來(lái)水洗凈（20次左右）每個(gè)孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3
遍，烤干5.超凈臺中紫外線(xiàn)照射2個(gè)小時(shí)左右，就可以用了，不可以高壓。或泡酸過(guò)夜，dd水沖洗干凈，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。
8)MTT法只能用來(lái)檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。
9）在用酶標儀檢測結果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗結果的線(xiàn)性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。
10)MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套。
11）配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以操作臺上的照明燈關(guān)掉。
2.目視比濁法
方法提要
濁度與透視度呈反比關(guān)系，水樣與標準系列進(jìn)行透視度比測，定值。本方法規定1000mL純水中含高嶺土1mg的濁度為1°。
本法適用于近海海域和大洋水濁度的測定。3個(gè)實(shí)驗室分析了用無(wú)濁純水配制水樣，濃度分別為7.0mg/L和50.0mg/L，測試結果重復性相對標準偏差為3.78%，相對誤差為4.10%。
試劑
無(wú)濁純水取蒸餾水或去離子水，通過(guò)0.2μm濾膜抽濾，貯存于聚乙烯桶中，用過(guò)濾水淋洗聚乙烯桶2次，棄去初濾水200mL，最好當天制備。
濾膜（0.2μm）。
二氯化汞溶液（50g/L）（注意：二氯化汞劇毒，小心操作！）。
焦磷酸鈉溶液（50g/L）。
高嶺土（機選特號）。
濁度標準儲備溶液將高嶺土置于（105±1）℃烘箱中烘干2h，移入盛有硅膠的干燥器中，冷卻30min。稱(chēng)取3~5g高嶺土，置于瑪瑙研缽中加少量水調成稀糊狀，研磨約50min，全部轉移入1000mL量筒中，補加純水到1000mL標線(xiàn)處，充分攪拌均勻后，在（20±0.5）℃下靜置24h。用虹吸法吸取上層800mL懸濁液移入第2個(gè)1000mL量筒中，補加無(wú)濁純水到1000mL標線(xiàn)處，充分攪勻后，再次置于（20±0.5）℃下靜放24h。用虹吸法吸除上層液800mL，留取底層200mL懸濁液并加純水到1000mL標線(xiàn)，然后盛于1000mL棕色試劑瓶中，塞嚴保存。
濁度標準儲備溶液濁度的標定量取50.0mL標準儲備溶液于恒量（m1）的蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上蒸干，移于105℃干燥箱中烘2h。置于硅膠干燥器中冷卻30min，稱(chēng)量（m2）。重復烘干、冷卻、稱(chēng)量步驟，直到兩次質(zhì)量差小于0.2mg。按下式計算濁度標準儲備溶液中高嶺土的質(zhì)量濃度：
巖石礦物分析第四分冊資源與環(huán)境調查分析技術(shù)
式中：ρ高嶺土為濁度標準儲備溶液中高嶺土的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為量取濁度標準儲備溶液的體積，50.0mL;m1為蒸發(fā)皿的質(zhì)量，g;m2為蒸發(fā)皿加烘干后高嶺土的質(zhì)量，g。
此濁度標準儲備溶液濁度=ρ高嶺土*1000。
濁度標準中間溶液準確量取一定體積含有250mg高嶺土的標準儲備溶液置于1000mL容量瓶中，加入1.0g二氯化汞（HgCl2）；溶解后，補加無(wú)濁純水至標線(xiàn)，充分混勻，轉入具橡皮塞的棕色試劑瓶中。此標準中間溶液濃度為0.25mg/mL。濁度為250°。
濁度標準溶液移取40.0mL濁度標準中間溶液置于100mL容量瓶中，加入0.50mL焦磷酸鈉溶液，加無(wú)濁純水至標線(xiàn)，混勻。此液濁度為100°。
校準曲線(xiàn)取12支100mL具塞比色管，分別加入0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL、9.00mL、10.0mL濁度標準溶液，再加入50.0mL二氯化汞溶液，然后再加無(wú)濁純水至標線(xiàn)，混勻。此系列濁度分別為0°、0.50°、1.00°、2.00°、3.00°、4.00°、5.00°、6.00°、7.00°、8.00°、9.00°、10.0°。
分析步驟
將混勻的水樣，傾入具塞比色管中至標線(xiàn)，立即同標準系列比較定量。水樣濁度為0°~10°范圍的測定，用黑色背景，垂直目視比較而定；10°以上的測定用黃色方格坐標紙為背景，水平透視方格線(xiàn)條的清晰程度而定量。然后將測定值記入渾濁度記錄表，取兩位有效讀數；若水樣濁度超過(guò)100°，則需用無(wú)濁純水稀釋水樣至可測范圍，將測定值乘以稀釋倍數，即為原水樣濁度。
注意事項
1）每次量取水樣或標準液時(shí)，必須將水樣瓶橫放，上下強烈振蕩30次后，立即取出水樣。
2）玻璃試劑瓶磨口與磨口塞之間，在啟瓶對磨中，可增大所盛液體的濁度。因此所用水樣瓶及試劑瓶，均應配換橡膠塞，并將膠塞置于盛純水的燒杯中煮沸2h。
3）水樣中具有迅速下沉的碎屑及粗大沉淀物都可被測定為濁度。不潔凈的玻璃器皿和空氣泡，以及擾亂水樣表面能見(jiàn)度的振動(dòng)都能造成虛假結果。
4）水樣保存，在取樣當天測定濁度。如果不可避免要保持更長(cháng)時(shí)間，將水樣保存暗處可達24h。如若在樣品中加HgCl2固定劑，可保存22d。
5）除非另作說(shuō)明，本法中所用試劑均為分析純，水為無(wú)濁水或等效純水。
3.比色法操作的注意事項是什么?
1選擇合適的熔樣方法，制備合適的試樣溶液（1）氫氧化鈉為熔劑，鹽酸分解；（2）碳酸鈉燒結，鹽酸分解或碳酸鈉燒結，氯化銨重量法測定純SiO。
時(shí)的濾液，以及純SiO。殘渣經(jīng)焦硫酸鉀熔融后分解溶液，二者合并；（3）碳酸鈉一硼砂為混合熔劑，稀硝酸和稀硫酸溶解后之濾液，或者稀硝酸溶解液，或濃鹽酸分解。
2顯色反應（1）掩蔽劑與顯色劑應有正確的配制和保存方法，否則影響吸光度。（2）顯色溫度與時(shí)間。
顯色反應有一定的溫度和時(shí)間要求，如高碘酸鉀氧化比色法分析MnO，應微沸10~15min使顯色完全，并冷卻至室溫下比色。二安替比林甲烷比色法分析TiO。
由于顯色反應較慢，顯色時(shí)間則需較長(cháng)時(shí)間（40min以上）。（3）比色。
比色儀器分光光度計應定期檢定，應選擇正確的波長(cháng)，合適光程的比色皿。色皿應保持干凈，受污染的比色皿可用稀硝酸浸洗，用鏡頭紙擦拭表面，比色皿內液體不能有氣泡或懸浮物。
通常情況下，比色測定在室溫進(jìn)行。
4.什么叫比色法?操作上應該注意什么問(wèn)題?
定義 以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過(guò)比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測組分含量的方法。
比色法作為一種定量分析的方法，開(kāi)始于19世紀30~40年代。比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恒定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。
選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關(guān)鍵。 常用方法 常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律[1](A=εbc)為基礎。
常用的目視比色法是標準系列法，即用不同量的待測物標準溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標準色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標準色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標準，由其中所含標準溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
光電比色法是在光電比色計上測量一系列標準溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制工作曲線(xiàn)，然后根據待測組分溶液的吸光度在工作曲線(xiàn)上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀(guān)誤差，提高了測量準確度，而且可以通過(guò)選擇濾光片來(lái)消除干擾，從而提高了選擇性。
但光電比色計采用鎢燈光源和濾光片，只適用于可見(jiàn)光譜區和只能 得到一定波長(cháng)范圍的復合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無(wú)論在測量的準確度、靈敏度和應用范圍上都不如紫外-可見(jiàn)分光光度計。20 世紀30~60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時(shí)期，此后就逐漸為分光光度法所代替。
比色法在無(wú)機材料分析中的應用及注意事項： 1比色法的應用比色法是利用溶液顏色的深淺來(lái)確定待測物質(zhì)含量的一種方法.在無(wú)機材料低含量成分分析中，與常用的滴定法、重量法比較，比色法具有較高的準確度和靈敏度.例如，TiO2滴定法，存在操作麻煩、終點(diǎn)顏色難以辨認的缺點(diǎn).礬土、普通礦渣、鐵礦石中的TiO2、MnO，粘土、水泥中的TiO2，石灰石中的SiO2、Al2O3、Fe2O3，硅砂中的Fe2O3等等，這些成份含量低，一般在5%以下，若采用滴定法分析，0.05ml的滴定量就造成較大的誤差，甚至未能檢測出結果.特別是硅質(zhì)玻璃原料硅砂中的Fe2O3，微量Fe2O3直接影響其產(chǎn)品質(zhì)量的評級，因此不能采用滴定法，而應采用比色法進(jìn)行分析（見(jiàn)JC/T753-2001硅質(zhì)玻璃原料化學(xué)分析方法）.比色法是無(wú)機材料化學(xué)成分分析的常用方法之一，TiO2、MnO、Al2O3、Fe2O3、SiO2等低含量成份，采用比色法可獲得較高的準確度，從而能更好地指導生產(chǎn).。
5.目視觀(guān)察法注意的事項有哪些
(1)試樣的控制，試樣受檢面必須保持完整，不允許有擦花或劃傷等破壞，而且受檢面必須清潔，不允許有污漬、油污等臟物覆蓋在受檢面上，因此測試前一般要用不破壞氧化膜的有機溶劑輕輕擦拭試樣表面； （2）試驗溶液濃度的控制，氫氧化鈉溶液的濃度必須嚴格控制到100g/L，濃度偏低或偏高將直接導致測試結果偏大或偏小； （3）試驗溫度的控制，試驗時(shí)不僅要保證試驗環(huán)境溫度控制在35℃±1℃，而且試驗溶液和試樣也必須控制在35℃±1℃，為此在測試前應先將試液和試樣放置于恒溫儀器中保持一段時(shí)間，只有當試液和試樣恒定在35℃±1℃之后才可以進(jìn)行測試。
6.目視觀(guān)察法的注意事項有哪些
對于滴堿試驗考慮的關(guān)鍵是，試驗溫度的控制以及如何準確地判斷氧化膜剛好被穿透的時(shí)間。
我國GB/T5237。2-2000中對滴堿試驗方法規定為：“在35℃±1℃下，將大約10mg、100g/LNaOH溶液滴至型材試樣的表面，目視觀(guān)察液滴處直至產(chǎn)生腐蝕冒泡，計算其氧化膜被穿透的時(shí)間。
也可用儀器測量氧化膜穿透的時(shí)間。”也就是說(shuō)，國標認可了兩種滴堿試驗方法，即目視觀(guān)察法和儀器測量法。
對于目試驗觀(guān)察法，國標描述的比較簡(jiǎn)單，試驗操作中的一些注意事項及其影響因素未作描述。而為了保證測試結果的準確性，在操作過(guò)程中對于影響因素應加以注意，以便盡可能減少或避免這些因素的影響，本方法應注意的事項主要有以下幾點(diǎn)： （1）試樣的控制，試樣受檢面必須保持完整，不允許有擦花或劃傷等破壞，而且受檢面必須清潔，不允許有污漬、油污等臟物覆蓋在受檢面上，因此測試前一般要用不破壞氧化膜的有機溶劑輕輕擦拭試樣表面； （2）試驗溶液濃度的控制，氫氧化鈉溶液的濃度必須嚴格控制到100g/L，濃度偏低或偏高將直接導致測試結果偏大或偏小； （3）試驗溫度的控制，試驗時(shí)不僅要保證試驗環(huán)境溫度控制在35℃±1℃，而且試驗溶液和試樣也必須控制在35℃±1℃，為此在測試前應先將試液和試樣放置于恒溫儀器中保持一段時(shí)間，只有當試液和試樣恒定在35℃±1℃之后才可以進(jìn)行測試；其四是恒溫儀器的選用，恒溫儀器的選用在本方法中是一個(gè)非常重要的環(huán)節，因為所選用的恒溫儀器不僅應起到恒溫的作用，還必須考慮要便于觀(guān)察儀器內試樣的變化情況，如果所選用的恒溫儀器沒(méi)有一個(gè)能夠清晰地觀(guān)察儀器內試樣變化情況的觀(guān)察口，那么要想準確地判斷出試樣何時(shí)開(kāi)始腐蝕冒泡是不大可能的。
另外，目視觀(guān)察法還受試驗人員經(jīng)驗的影響，在實(shí)際檢驗工作中發(fā)現，從陽(yáng)極氧化膜開(kāi)始溶解到氧化膜被穿透（試樣開(kāi)始腐蝕冒泡）這一過(guò)程中并沒(méi)有一個(gè)很明顯的變化，給氧化膜穿透時(shí)間的判斷帶來(lái)很大難度，這就對試驗人員提出了很高的要求，試驗人員必須要有非常豐富的實(shí)踐經(jīng)驗，能夠準確地判斷出氧化膜何時(shí)被穿透而開(kāi)始腐蝕冒泡。
7.如何用目視比色法快速測試果園土壤和果樹(shù)植株氮磷鉀速效養分
第一步：果園土壤和果樹(shù)植物供試液的制備。
土壤中易被作物吸收利用的養分稱(chēng)為土壤速效養分，這些養 分主要存在于土壤溶液和土壤膠體上，用適當的酸、堿或鹽類(lèi)的 溶液處理土壤，可將它們溶解和代換出來(lái)i①測定土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效鉀供試液的制備（此為供 試液I）。 稱(chēng)取相當于2克干土的濕土，放入干凈的小浸提杯中，用量筒加入0。
5摩爾/升硫酸鈉（Na2S04? 10H2O）溶液10毫 升，蓋好杯子，用力上下?lián)u動(dòng)300次后，打開(kāi)杯蓋，將折疊好的7厘米中速濾紙，使尖端向下放入小杯子中，以滲透于濾紙錐形 - 體內的清液供測試硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和速效鉀備用。 ②測定土壤速效憐供試液的制備（此為供試液II）。
稱(chēng)取相 當于2克干土的濕土，放入干凈的小浸提杯中，用量筒加人0。5 摩爾/升碳酸氫鈉（NaHC03）浸提劑10毫升，蓋好杯子，振蕩 和滲濾方法同供試液工。
③植物供試液的制備（此為供試液IE）。果樹(shù)根系自土壤中 吸收的無(wú)機養分，在果樹(shù)根系、枝、葉等組織液中有所積累，用 組織汁液測定它們的含量，可以反應土壤養分的供應狀況，作為 營(yíng)養水平的指標。
制備植物供試液的方法很多，現介紹用冷水浸 提制備供試液：把處理好的果樹(shù)待測部位（一般是葉片或葉柄）取下，用剪 刀剪碎，在1/100托盤(pán)天平上稱(chēng)樣0。5克，放入小浸提杯中，并 用玻璃棒搗碎，然后加蒸餾水10毫升，蓋好杯子紀振蕩和滲濾 步驟同土壤供試液的制備。
第二步：果園土壤和果樹(shù)植株速效氮磷鉀養分的測定。①土壤和植株中硝態(tài)氮（N03— N）的測定3制備標準色階 和供試液中硝態(tài)氮的測定，可同時(shí)在比色盤(pán)中，按硝態(tài)氮測定表 5 - 5進(jìn)行。
表格里的雙線(xiàn)左上方，為制備比色標準溶液，。
雙線(xiàn)的右上方 為待測試液，只有在標準溶液和待測溶液都按要求依次制備好 后，才能同時(shí)按雙線(xiàn)以下各操作步驟進(jìn)行。
8.目視比色法的缺點(diǎn)
目視比色法的主要缺點(diǎn)是準確度不高，如果待測液中存在第二種有色物質(zhì)，甚至會(huì )無(wú)法進(jìn)行測定。另外，由于許多有色溶液顏色不穩定，標準系列不能久存，經(jīng)常需在測定時(shí)配制，比較麻煩。雖然可采用其某些穩定的有色物質(zhì) （ 如重鉻酸鉀、硫酸銅和硫酸鈷等 ） 配制永久性標準系列，或利用有色塑料、有色玻璃制成永久色階，但由于它們的顏色與試液的顏色往往有差異，也需要進(jìn)行校正。
9.大家能不能介紹一下比色法
通過(guò)比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測組分含量的方法以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過(guò)比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來(lái)確定待測組分含量的方法。
比色法作為一種定量分析的方法，開(kāi)始于19世紀30~40年代。比色分析對顯色反應的基本要求是：反應應具有較高的靈敏度和選擇性，反應生成的有色化合物的組成恒定且較穩定，它和顯色劑的顏色差別較大。
選擇適當的顯色反應和控制好適宜的反應條件，是比色分析的關(guān)鍵。 常用的比色法有兩種：目視比色法和光電比色法，兩種方法都是以朗伯-比爾定律[1](A=εbc)為基礎。
常用的目視比色法是標準系列法，即用不同量的待測物標準溶液在完全相同的一組比色管中，先按分析步驟顯色，配成顏色逐漸遞變的標準色階。試樣溶液也在完全相同條件下顯色，和標準色階作比較，目視找出色澤最相近的那一份標準，由其中所含標準溶液的量，計算確定試樣中待測組分的含量。
光電比色法是在光電比色計上測量一系列標準溶液的吸光度，將吸光度對濃度作圖，繪制工作曲線(xiàn)，然后根據待測組分溶液的吸光度在工作曲線(xiàn)上查得其濃度或含量。與目視比色法相比，光電比色法消除了主觀(guān)誤差，提高了測量準確度，而且可以通過(guò)選擇濾光片來(lái)消除干擾，從而提高了選擇性。
但光電比色計采用鎢燈光源和濾光片，只適用于可見(jiàn)光譜區和只能 得到一定波長(cháng)范圍的復合光 ， 而不是單色光束，還有其他一些局限，使它無(wú)論在測量的準確度、靈敏度和應用范圍上都不如紫外-可見(jiàn)分光光度計。20 世紀30~60年代，是比色法發(fā)展的旺盛時(shí)期，此后就逐漸為分光光度法所代替。
