工業(yè)發(fā)酵的滅菌方法(發(fā)酵過程中采用的滅菌方法原理和條件)
1.發(fā)酵過程中采用的滅菌方法、原理和條件
發(fā)酵過程中采用的滅菌方法、原理和條件
采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施，成為滅菌。滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾除菌等。可根據(jù)不同的需求，采用不同的方法，如培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌，空氣則采用過濾除菌 。
滅菌的徹底程度受滅菌時間與滅菌劑強(qiáng)度的制約。微生物對滅菌劑的抵抗力取決于原始存在的群體密度、菌種或環(huán)境賦予菌種的抵抗力。滅菌是獲得純培養(yǎng)的必要條件，也是食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中必需的技術(shù)。
方法概述滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾除菌等。可根據(jù)不同的需求，采用不同的方法，如培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌，空氣則采用過濾除菌。
熱滅菌法
熱滅菌法利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的一切蛋白質(zhì)變性，酶活性消失，致使細(xì)胞死亡。通常有干熱、濕熱和間歇加熱滅菌等法。
干熱滅菌
火焰灼燒法或烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法稱為干熱滅菌法（dryheatsterilization）。
把金屬器械或洗凈的玻璃器皿放入電熱烘箱內(nèi)，在150~170℃下維持1~2小時后，可達(dá)到徹底滅菌（包括細(xì)菌的芽孢）的目的。灼燒（incineration或combustion）是一種最徹底的干熱滅菌法，應(yīng)用范圍僅限于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動物尸體的燒毀等。
濕熱滅菌
以沸水、蒸氣和蒸氣加壓滅菌。
巴氏消毒法：因最早由法國微生物學(xué)家巴斯德用于果酒消毒，故名。這是一種專用于牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液態(tài)風(fēng)味食品或調(diào)料的低溫消毒方法[1]
巴氏滅菌法就是濕熱滅菌，此法有兩種方式[1]
①經(jīng)典的低溫維持法（,LTH）：在61.7~62.8℃下處理30分鐘；②較現(xiàn)代的高溫瞬時法（或flushpoint,HTST）：在71.6℃或略高溫度下處理15分鐘。在上述諸法中，以蒸氣加壓滅菌效果最好，可用常壓蒸氣滅菌，也可在高壓蒸氣鍋中（一般使用1千克/厘米2）滅菌，其蒸氣溫度可達(dá)121℃，能將耐熱的芽孢在30分鐘內(nèi)全部殺死。但對某些易被高壓破壞的物質(zhì)，如某些糖或有機(jī)含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2壓力下（110℃）滅菌15~30分鐘。
煮沸消毒法：采用在100℃下煮沸數(shù)分鐘的方法，一般用于飲用水的消毒[1] 。
間歇滅菌
間歇滅菌連續(xù)3天，每天進(jìn)行一次蒸氣滅菌的方法。此法適用于不能耐 100℃以上溫度的物質(zhì)和一些糖類或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。一般是在正常大氣壓下用蒸氣滅菌
1小時。滅菌溫度不超過100℃，不致造成糖類等物質(zhì)的破壞，而可將間歇培養(yǎng)期間萌發(fā)的孢子殺死，從而達(dá)到徹底滅菌的目的。
輻射滅菌
輻射滅菌在一定條件下利用射線進(jìn)行滅菌的方法。較常用的有紫外線，其他還有電離輻射（射線加快中子等）。波長在25000~80000納米之間的激光也有強(qiáng)烈的殺菌能力，以波長26500納米最有效。輻射滅菌法僅限于某一定材料，因所需設(shè)備復(fù)雜，難于廣泛使用。
滲透壓滅菌
滲透壓滅菌利用高滲透壓溶液進(jìn)行滅菌的方法。在高濃度的食鹽或糖溶液中細(xì)胞因脫水而發(fā)生質(zhì)壁分離，不能進(jìn)行正常的新陳代謝，結(jié)果導(dǎo)致微生物的死亡。
化學(xué)試劑滅菌
大多數(shù)化學(xué)藥劑在低濃度下起抑菌作用，高濃度下起殺菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等?；瘜W(xué)滅菌劑必須有揮發(fā)性，以便清除滅菌后材料上殘余的藥物。
化學(xué)滅菌常用的試劑有表面消毒劑、抗代謝藥物（磺胺類等）、抗生素、生物藥物素抗生素是一類有微生物或其他生物生命活動過程中的合成的次生代謝產(chǎn)物或人工衍生物，他們在很低濃度時就能抑制或感染它種生物（包括病原菌，病毒，癌細(xì)胞等）的生命活動，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑。
2.什么叫滅菌
(1)加熱滅菌法 利用高溫來殺死微生物（超過最高生長溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當(dāng)高溫作用于微生物時，首先引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率加快，機(jī)體內(nèi)對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體的變化、酶結(jié)構(gòu)的破壞，從而使細(xì)胞失去了生活機(jī)能上的協(xié)調(diào)，停止了生長發(fā)育。隨著高溫的繼續(xù)作用，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結(jié)構(gòu)完全破壞，活動消失，生化反應(yīng)停止，滲透交換等新陳代謝活動消失，細(xì)胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡單，故在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強(qiáng)的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細(xì)菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時，可將壓力增加到0.152兆帕，延長至1~2小時。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時，要完全排出鍋內(nèi)的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內(nèi)溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時間，應(yīng)根據(jù)待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。
它設(shè)備簡單、成本低，當(dāng)前使用最廣泛。只要砌一個爐灶，買1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過大，以裝800~1500瓶為好。
設(shè)計常壓灶時應(yīng)注意的問題：大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內(nèi)壁下流而不會打濕棉塞；灶倉內(nèi)要有層架結(jié)構(gòu)，以便分層裝入滅菌物；灶上應(yīng)安裝溫度計，可隨時觀察灶內(nèi)溫度的變化；因滅菌時間長，鍋內(nèi)水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節(jié)省燃料。菇農(nóng)在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開后保持8~10小時，悶一夜即可。
圖2-7 簡易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復(fù)幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內(nèi)，100℃處理1小時左右，殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，讓其冷卻至30℃左右，此時芽胞會萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復(fù)3次，可達(dá)到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時間，殺死有害微生物的方法。
適應(yīng)于不耐高溫的物品消毒。有些培養(yǎng)基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營養(yǎng)體，又能使培養(yǎng)基的成分不致受到嚴(yán)重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養(yǎng)料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個原理殺死其中的病蟲、雜菌。 （2）過濾除菌法 又分液體過濾和空氣過濾兩種，就是采用機(jī)械的方法，設(shè)計一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器，通過機(jī)械過濾，只讓液體培養(yǎng)基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達(dá)到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基（如動物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過過濾滅菌形成無菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來造成工作臺范圍的無菌狀態(tài)。
過濾滅菌的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線、β-射線、γ-射線、X-射線、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線滅菌 紫外線殺菌的原理是利用紫外線的輻射作用。用燈管直接照射細(xì)菌使其發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，將細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復(fù)制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養(yǎng)室的上方，個數(shù)依房間大小而定，容1~2個人操作的接種室，安裝一個30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應(yīng)將所需的器具一起放入接種室（箱）內(nèi)，然后打開紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開燈照射2小時。
3.常用的滅菌方法有哪些,各有哪些優(yōu)缺點
(1)加熱滅菌法 利用高溫來殺死微生物（超過最高生長溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當(dāng)高溫作用于微生物時，首先引起細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率加快，機(jī)體內(nèi)對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體的變化、酶結(jié)構(gòu)的破壞，從而使細(xì)胞失去了生活機(jī)能上的協(xié)調(diào)，停止了生長發(fā)育。隨著高溫的繼續(xù)作用，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結(jié)構(gòu)完全破壞，活動消失，生化反應(yīng)停止，滲透交換等新陳代謝活動消失，細(xì)胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡單，故在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強(qiáng)的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細(xì)菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時，可將壓力增加到0.152兆帕，延長至1~2小時。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時，要完全排出鍋內(nèi)的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內(nèi)溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養(yǎng)基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時間，應(yīng)根據(jù)待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。
它設(shè)備簡單、成本低，當(dāng)前使用最廣泛。只要砌一個爐灶，買1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過大，以裝800~1500瓶為好。
設(shè)計常壓灶時應(yīng)注意的問題：大小根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模來定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內(nèi)壁下流而不會打濕棉塞；灶倉內(nèi)要有層架結(jié)構(gòu)，以便分層裝入滅菌物；灶上應(yīng)安裝溫度計，可隨時觀察灶內(nèi)溫度的變化；因滅菌時間長，鍋內(nèi)水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節(jié)省燃料。菇農(nóng)在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開后保持8~10小時，悶一夜即可。
圖2-7 簡易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復(fù)幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內(nèi)，100℃處理1小時左右，殺死微生物的營養(yǎng)細(xì)胞，讓其冷卻至30℃左右，此時芽胞會萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復(fù)3次，可達(dá)到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營養(yǎng)物、特殊培養(yǎng)基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時間，殺死有害微生物的方法。
適應(yīng)于不耐高溫的物品消毒。有些培養(yǎng)基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營養(yǎng)體，又能使培養(yǎng)基的成分不致受到嚴(yán)重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養(yǎng)料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個原理殺死其中的病蟲、雜菌。 （2）過濾除菌法 又分液體過濾和空氣過濾兩種，就是采用機(jī)械的方法，設(shè)計一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器，通過機(jī)械過濾，只讓液體培養(yǎng)基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達(dá)到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基（如動物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過過濾滅菌形成無菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來造成工作臺范圍的無菌狀態(tài)。
過濾滅菌的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線、β-射線、γ-射線、X-射線、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線滅菌 紫外線殺菌的原理是利用紫外線的輻射作用。用燈管直接照射細(xì)菌使其發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，將細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復(fù)制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養(yǎng)室的上方，個數(shù)依房間大小而定，容1~2個人操作的接種室，安裝一個30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應(yīng)將所需的器具一起放入接種室（箱）內(nèi)，然后打開紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開燈照射2小時。
4.反應(yīng)器滅菌方式有哪幾種
在發(fā)酵行業(yè)中，隨著國家GMP標(biāo)準(zhǔn)的不斷提升，對生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌操作成為必不可少的環(huán)節(jié)，滅菌操作不到位，很容易使生物反應(yīng)器在運作過程中將對發(fā)酵產(chǎn)品造成污染，導(dǎo)大的損失。因此，滅菌的技巧很重要。
1.取下生物反應(yīng)器的馬達(dá)，平放于桌上，罐頂端套上黑色保護(hù)帽；
2.由罐上取下溫度傳感器，傳感器不需要滅菌；
3.取下PH電纜線，蓋上紅色保護(hù)帽；將PH電極要插到底；務(wù)必擰緊電極的上下兩個固定螺帽；PH電極滅菌前要標(biāo)定，PH電極校正后不要關(guān)控制器；
4.取下DO電纜線，DO電纜接口處用錫箔紙包好后套上黑色帽。DO電極滅菌完后標(biāo)定。DO電極要插到底，擰緊電極的上下兩個固定螺帽。滅菌前要注意溶氧電極里頭的保護(hù)液是否還有，沒有則要進(jìn)行添加；
5.取下消泡或液位電纜線，將消泡或液位電纜插到底，滅菌后定位到所需要的高度后就不要再壓下去，消泡電極的高度離液面約1.5cm處；
6.拆下生物反應(yīng)器上和冷凝器上的進(jìn)、出水管，拆下的同時要用夾子夾住拆下水管的接頭處，以防水流出；
7.生物反應(yīng)器上的過濾器的兩端多要用夾子夾死，過濾器的出口處用錫箔包好，所有過濾器的兩端多要用夾子夾住；發(fā)酵完畢倒罐后注意檢查過濾器是否被打濕，若有則趕快用吸球?qū)⑵渲械囊后w吹出；
8.在滅菌前，將生物反應(yīng)器的六個固定螺帽擰松出氣，其他螺帽一定要擰緊；滅菌完后打開高壓鍋后立刻將其擰緊，注意戴上手套防止被燙傷；
9.不要放高壓鍋內(nèi)滅菌，將空的酸液瓶上的過濾器用錫箔包好，并將瓶蓋擰松出汽。滅菌完后去掉錫箔過濾器上的錫箔紙作為出汽口；堿液瓶和硅膠管可以一起滅菌（與堿液瓶相連的硅膠管要卡死）；
10.取下電熱夾套將其平鋪于桌面；
11.滅菌前調(diào)整好攪拌葉的位置，底下的攪拌葉盡量靠近空氣分布器，上面的一個位置調(diào)整到所加發(fā)酵液的中間位置；
12.取樣器的位置不要靠近擋板的位置，盡量靠中間位置；
13.滅菌前將取樣器的吸球取下；所有的硅膠管不要靠到高壓鍋的內(nèi)壁上。
