工業(yè)發(fā)酵的滅菌方法(發(fā)酵過(guò)程中采用的滅菌方法原理和條件)
1.發(fā)酵過(guò)程中采用的滅菌方法、原理和條件
發(fā)酵過(guò)程中采用的滅菌方法、原理和條件
采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長(cháng)繁殖能力的措施，成為滅菌。滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌、射線(xiàn)滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過(guò)濾除菌等。可根據不同的需求，采用不同的方法，如培養基滅菌一般采用濕熱滅菌，空氣則采用過(guò)濾除菌 。
滅菌的徹底程度受滅菌時(shí)間與滅菌劑強度的制約。微生物對滅菌劑的抵抗力取決于原始存在的群體密度、菌種或環(huán)境賦予菌種的抵抗力。滅菌是獲得純培養的必要條件，也是食品工業(yè)和醫藥領(lǐng)域中必需的技術(shù)。
方法概述滅菌常用的方法有化學(xué)試劑滅菌、射線(xiàn)滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過(guò)濾除菌等。可根據不同的需求，采用不同的方法，如培養基滅菌一般采用濕熱滅菌，空氣則采用過(guò)濾除菌。
熱滅菌法
熱滅菌法利用高溫使微生物細胞內的一切蛋白質(zhì)變性，酶活性消失，致使細胞死亡。通常有干熱、濕熱和間歇加熱滅菌等法。
干熱滅菌
火焰灼燒法或烘箱內熱空氣滅菌法稱(chēng)為干熱滅菌法（dryheatsterilization）。
把金屬器械或洗凈的玻璃器皿放入電熱烘箱內，在150~170℃下維持1~2小時(shí)后，可達到徹底滅菌（包括細菌的芽孢）的目的。灼燒（incineration或combustion）是一種最徹底的干熱滅菌法，應用范圍僅限于接種環(huán)、接種針的滅菌或帶病原菌的材料、動(dòng)物尸體的燒毀等。
濕熱滅菌
以沸水、蒸氣和蒸氣加壓滅菌。
巴氏消毒法：因最早由法國微生物學(xué)家巴斯德用于果酒消毒，故名。這是一種專(zhuān)用于牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進(jìn)行高溫滅菌的液態(tài)風(fēng)味食品或調料的低溫消毒方法[1]
巴氏滅菌法就是濕熱滅菌，此法有兩種方式[1]
①經(jīng)典的低溫維持法（,LTH）：在61.7~62.8℃下處理30分鐘；②較現代的高溫瞬時(shí)法（或flushpoint,HTST）：在71.6℃或略高溫度下處理15分鐘。在上述諸法中，以蒸氣加壓滅菌效果最好，可用常壓蒸氣滅菌，也可在高壓蒸氣鍋中（一般使用1千克/厘米2）滅菌，其蒸氣溫度可達121℃，能將耐熱的芽孢在30分鐘內全部殺死。但對某些易被高壓破壞的物質(zhì)，如某些糖或有機含氮化合物，宜在0.6千克/厘米2壓力下（110℃）滅菌15~30分鐘。
煮沸消毒法：采用在100℃下煮沸數分鐘的方法，一般用于飲用水的消毒[1] 。
間歇滅菌
間歇滅菌連續3天，每天進(jìn)行一次蒸氣滅菌的方法。此法適用于不能耐 100℃以上溫度的物質(zhì)和一些糖類(lèi)或蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。一般是在正常大氣壓下用蒸氣滅菌
1小時(shí)。滅菌溫度不超過(guò)100℃，不致造成糖類(lèi)等物質(zhì)的破壞，而可將間歇培養期間萌發(fā)的孢子殺死，從而達到徹底滅菌的目的。
輻射滅菌
輻射滅菌在一定條件下利用射線(xiàn)進(jìn)行滅菌的方法。較常用的有紫外線(xiàn)，其他還有電離輻射（射線(xiàn)加快中子等）。波長(cháng)在25000~80000納米之間的激光也有強烈的殺菌能力，以波長(cháng)26500納米最有效。輻射滅菌法僅限于某一定材料，因所需設備復雜，難于廣泛使用。
滲透壓滅菌
滲透壓滅菌利用高滲透壓溶液進(jìn)行滅菌的方法。在高濃度的食鹽或糖溶液中細胞因脫水而發(fā)生質(zhì)壁分離，不能進(jìn)行正常的新陳代謝，結果導致微生物的死亡。
化學(xué)試劑滅菌
大多數化學(xué)藥劑在低濃度下起抑菌作用，高濃度下起殺菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化學(xué)滅菌劑必須有揮發(fā)性，以便清除滅菌后材料上殘余的藥物。
化學(xué)滅菌常用的試劑有表面消毒劑、抗代謝藥物（磺胺類(lèi)等）、抗生素、生物藥物素抗生素是一類(lèi)有微生物或其他生物生命活動(dòng)過(guò)程中的合成的次生代謝產(chǎn)物或人工衍生物，他們在很低濃度時(shí)就能抑制或感染它種生物（包括病原菌，病毒，癌細胞等）的生命活動(dòng)，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑。
2.什么叫滅菌
(1)加熱滅菌法 利用高溫來(lái)殺死微生物（超過(guò)最高生長(cháng)溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當高溫作用于微生物時(shí)，首先引起細胞內生理生化反應速率加快，機體內對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著(zhù)溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導致細胞內原生質(zhì)體的變化、酶結構的破壞，從而使細胞失去了生活機能上的協(xié)調，停止了生長(cháng)發(fā)育。隨著(zhù)高溫的繼續作用，細胞內原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結構完全破壞，活動(dòng)消失，生化反應停止，滲透交換等新陳代謝活動(dòng)消失，細胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類(lèi)。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒(méi)有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱(chēng)為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡(jiǎn)單，故在生產(chǎn)上廣泛應用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱(chēng)焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來(lái)滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時(shí)間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時(shí)，可將壓力增加到0.152兆帕，延長(cháng)至1~2小時(shí)。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時(shí)，要完全排出鍋內的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時(shí)間，應根據待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類(lèi)型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。
它設備簡(jiǎn)單、成本低，當前使用最廣泛。只要砌一個(gè)爐灶，買(mǎi)1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過(guò)大，以裝800~1500瓶為好。
設計常壓灶時(shí)應注意的問(wèn)題：大小根據生產(chǎn)規模來(lái)定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內壁下流而不會(huì )打濕棉塞；灶倉內要有層架結構，以便分層裝入滅菌物；灶上應安裝溫度計，可隨時(shí)觀(guān)察灶內溫度的變化；因滅菌時(shí)間長(cháng)，鍋內水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節省燃料。菇農在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡(jiǎn)便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開(kāi)后保持8~10小時(shí)，悶一夜即可。
圖2-7 簡(jiǎn)易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內，100℃處理1小時(shí)左右，殺死微生物的營(yíng)養細胞，讓其冷卻至30℃左右，此時(shí)芽胞會(huì )萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復3次，可達到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營(yíng)養物、特殊培養基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時(shí)間，殺死有害微生物的方法。
適應于不耐高溫的物品消毒。有些培養基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營(yíng)養體，又能使培養基的成分不致受到嚴重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個(gè)原理殺死其中的病蟲(chóng)、雜菌。 （2）過(guò)濾除菌法 又分液體過(guò)濾和空氣過(guò)濾兩種，就是采用機械的方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器，通過(guò)機械過(guò)濾，只讓液體培養基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩定的體積小的液體培養基（如動(dòng)物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過(guò)過(guò)濾滅菌形成無(wú)菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來(lái)造成工作臺范圍的無(wú)菌狀態(tài)。
過(guò)濾滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過(guò)濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱(chēng)輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線(xiàn)、β-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)、X-射線(xiàn)、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線(xiàn)、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線(xiàn)滅菌 紫外線(xiàn)殺菌的原理是利用紫外線(xiàn)的輻射作用。用燈管直接照射細菌使其發(fā)生光化學(xué)反應，將細菌細胞質(zhì)誘導形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線(xiàn)照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線(xiàn)的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養室的上方，個(gè)數依房間大小而定，容1~2個(gè)人操作的接種室，安裝一個(gè)30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應將所需的器具一起放入接種室（箱）內，然后打開(kāi)紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開(kāi)燈照射2小時(shí)。
3.常用的滅菌方法有哪些,各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)
(1)加熱滅菌法 利用高溫來(lái)殺死微生物（超過(guò)最高生長(cháng)溫度）的方法。
加熱滅菌的原理：當高溫作用于微生物時(shí)，首先引起細胞內生理生化反應速率加快，機體內對溫度敏感的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等，隨著(zhù)溫度的增高而遭受不可逆的破壞，盡而導致細胞內原生質(zhì)體的變化、酶結構的破壞，從而使細胞失去了生活機能上的協(xié)調，停止了生長(cháng)發(fā)育。隨著(zhù)高溫的繼續作用，細胞內原生質(zhì)便發(fā)生凝固，酶結構完全破壞，活動(dòng)消失，生化反應停止，滲透交換等新陳代謝活動(dòng)消失，細胞死亡。
加熱滅菌可分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類(lèi)。 1）干熱滅菌 利用灼燒或干熱空氣滅菌而沒(méi)有飽和水蒸氣參加的滅菌法稱(chēng)為干熱滅菌法。
由于干熱滅菌使用方便，方法簡(jiǎn)單，故在生產(chǎn)上廣泛應用。如火焰滅菌法：直接利用火焰把微生物燒死，故又稱(chēng)焚燒滅菌法。
采用此法滅菌既徹底又迅速，但只適用于金屬制的接種工具、試管口及污染物品等的處理。熱空氣滅菌法：即在電熱恒溫干燥箱中利用干熱空氣來(lái)滅菌。
2）濕熱滅菌 即利用蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。濕熱滅菌又分為高壓、常壓、間歇滅菌和巴氏滅菌4種。
①高壓蒸汽滅菌 由于高壓蒸汽具有較強的穿透力和較常壓高的溫度，能大大縮短滅菌時(shí)間，提高工作效率，加之蛋白質(zhì)在濕熱條件下容易變性，在熱蒸汽條件下，細菌的芽孢在120℃，經(jīng)20~30分鐘可全部被殺死。如滅菌材料體積較大，不易被穿透時(shí)，可將壓力增加到0.152兆帕，延長(cháng)至1~2小時(shí)。
在高壓蒸汽滅菌中，滅菌溫度隨蒸汽壓力的增加而升高（圖2-6）。 圖2-6 高壓蒸汽滅菌鍋 在使用高壓滅菌鍋時(shí)，要完全排出鍋內的空氣而以飽和蒸汽代之。
如果空氣不排除干凈，則鍋內溫度將低于同樣壓力下由純飽和蒸汽產(chǎn)生的溫度，影響滅菌效果。 此法適用于各種耐熱物品的滅菌，如一般培養基、生理鹽水等各種溶液、玻璃器皿、工作服等。
所采用的蒸汽壓力與時(shí)間，應根據待滅菌物品的性質(zhì)、體積與容器類(lèi)型等決定。 ②常壓蒸汽滅菌 這是采用自然壓力、100℃蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。
它設備簡(jiǎn)單、成本低，當前使用最廣泛。只要砌一個(gè)爐灶，買(mǎi)1~2只大鍋，上面用磚和水泥砌成，也可用大鐵桶、木桶等，體積大小可自行決定，但不宜過(guò)大，以裝800~1500瓶為好。
設計常壓灶時(shí)應注意的問(wèn)題：大小根據生產(chǎn)規模來(lái)定，灶頂部最好制成拱圓形，這樣冷凝水可沿灶的內壁下流而不會(huì )打濕棉塞；灶倉內要有層架結構，以便分層裝入滅菌物；灶上應安裝溫度計，可隨時(shí)觀(guān)察灶內溫度的變化；因滅菌時(shí)間長(cháng)，鍋內水不夠蒸發(fā)，故容量大的灶要安裝加水裝置；灶倉的密閉程度要盡可能高，這樣既提高滅菌效果，又節省燃料。菇農在生產(chǎn)中還常用一種小型蒸汽發(fā)生裝置，引出蒸汽后直接通到下邊用木條塹起、四周用多層塑料布密封的菌袋堆中進(jìn)行常壓滅菌。
這種方法不用建灶，簡(jiǎn)便省工（圖2-7）。常壓滅菌一般水燒開(kāi)后保持8~10小時(shí)，悶一夜即可。
圖2-7 簡(jiǎn)易常壓滅菌法 ③常壓間歇蒸汽滅菌法 這是利用常壓蒸汽反復幾次滅菌的方法。具體做法是將待滅菌物品放在鍋內，100℃處理1小時(shí)左右，殺死微生物的營(yíng)養細胞，讓其冷卻至30℃左右，此時(shí)芽胞會(huì )萌發(fā)，再以同樣方法加熱處理，反復3次，可達到滅菌目的。
該方法可用于不耐高溫的藥品、營(yíng)養物、特殊培養基的滅菌。 ④低溫巴氏滅菌法 即在60~70℃下，經(jīng)一定時(shí)間，殺死有害微生物的方法。
適應于不耐高溫的物品消毒。有些培養基，在高溫下遭到破壞，用此法既可殺死致病微生物的營(yíng)養體，又能使培養基的成分不致受到嚴重破壞。
食用菌生產(chǎn)中培養料堆積發(fā)酵工藝，就是利用這個(gè)原理殺死其中的病蟲(chóng)、雜菌。 （2）過(guò)濾除菌法 又分液體過(guò)濾和空氣過(guò)濾兩種，就是采用機械的方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器，通過(guò)機械過(guò)濾，只讓液體培養基或空氣從篩孔流出，各種微生物菌體則留在篩子上，從而達到除菌的目的。
這種方法適用于對熱不穩定的體積小的液體培養基（如動(dòng)物血清、蛋白質(zhì)、酶、維生素等）及氣體的滅菌。超凈工作臺的工作原理就是將帶菌空氣通過(guò)過(guò)濾滅菌形成無(wú)菌空氣，從風(fēng)洞中吹出，來(lái)造成工作臺范圍的無(wú)菌狀態(tài)。
過(guò)濾滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。常用的過(guò)濾器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉膠、硝化纖維素濾膜制成的。
（3）輻射滅菌法 利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行殺菌的方法稱(chēng)輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α-射線(xiàn)、β-射線(xiàn)、γ-射線(xiàn)、X-射線(xiàn)、中子和質(zhì)子、微波等屬電離輻射，紫外線(xiàn)、臭氧、日光為非電離輻射。
1）紫外線(xiàn)滅菌 紫外線(xiàn)殺菌的原理是利用紫外線(xiàn)的輻射作用。用燈管直接照射細菌使其發(fā)生光化學(xué)反應，將細菌細胞質(zhì)誘導形成胸腺嘧啶雙聚體，從而抑制DNA的復制而發(fā)生變性、致死。
另一方面，空氣在紫外線(xiàn)照射下產(chǎn)生的臭氧（O3），也具有一定的殺菌作用。紫外線(xiàn)的有效作用距離為1.2~2.0米。
紫外燈一般懸吊在接種室或培養室的上方，個(gè)數依房間大小而定，容1~2個(gè)人操作的接種室，安裝一個(gè)30瓦的紫外燈就可以了。在每次接種前，應將所需的器具一起放入接種室（箱）內，然后打開(kāi)紫外燈照射。
如果接種室體積較大，開(kāi)燈照射2小時(shí)。
4.反應器滅菌方式有哪幾種
在發(fā)酵行業(yè)中，隨著(zhù)國家GMP標準的不斷提升，對生物反應器進(jìn)行滅菌操作成為必不可少的環(huán)節，滅菌操作不到位，很容易使生物反應器在運作過(guò)程中將對發(fā)酵產(chǎn)品造成污染，導大的損失。因此，滅菌的技巧很重要。
1.取下生物反應器的馬達，平放于桌上，罐頂端套上黑色保護帽；
2.由罐上取下溫度傳感器，傳感器不需要滅菌；
3.取下PH電纜線(xiàn)，蓋上紅色保護帽；將PH電極要插到底；務(wù)必擰緊電極的上下兩個(gè)固定螺帽；PH電極滅菌前要標定，PH電極校正后不要關(guān)控制器；
4.取下DO電纜線(xiàn)，DO電纜接口處用錫箔紙包好后套上黑色帽。DO電極滅菌完后標定。DO電極要插到底，擰緊電極的上下兩個(gè)固定螺帽。滅菌前要注意溶氧電極里頭的保護液是否還有，沒(méi)有則要進(jìn)行添加；
5.取下消泡或液位電纜線(xiàn)，將消泡或液位電纜插到底，滅菌后定位到所需要的高度后就不要再壓下去，消泡電極的高度離液面約1.5cm處；
6.拆下生物反應器上和冷凝器上的進(jìn)、出水管，拆下的同時(shí)要用夾子夾住拆下水管的接頭處，以防水流出；
7.生物反應器上的過(guò)濾器的兩端多要用夾子夾死，過(guò)濾器的出口處用錫箔包好，所有過(guò)濾器的兩端多要用夾子夾住；發(fā)酵完畢倒罐后注意檢查過(guò)濾器是否被打濕，若有則趕快用吸球將其中的液體吹出；
8.在滅菌前，將生物反應器的六個(gè)固定螺帽擰松出氣，其他螺帽一定要擰緊；滅菌完后打開(kāi)高壓鍋后立刻將其擰緊，注意戴上手套防止被燙傷；
9.不要放高壓鍋內滅菌，將空的酸液瓶上的過(guò)濾器用錫箔包好，并將瓶蓋擰松出汽。滅菌完后去掉錫箔過(guò)濾器上的錫箔紙作為出汽口；堿液瓶和硅膠管可以一起滅菌（與堿液瓶相連的硅膠管要卡死）；
10.取下電熱夾套將其平鋪于桌面；
11.滅菌前調整好攪拌葉的位置，底下的攪拌葉盡量靠近空氣分布器，上面的一個(gè)位置調整到所加發(fā)酵液的中間位置；
12.取樣器的位置不要靠近擋板的位置，盡量靠中間位置；
13.滅菌前將取樣器的吸球取下；所有的硅膠管不要靠到高壓鍋的內壁上。
