利用薄層層析分析蛋黃脂質(zhì)的(薄層色譜操作注意事項(xiàng))

1.薄層色譜操作注意事項(xiàng)

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薄層色譜操作注意事項(xiàng)

影響薄層色譜分析的因素有很多，比如樣品處理方法、薄層板制備技巧、點(diǎn)樣方法、展開劑的遴選、溫濕度的掌控等等很多方面，在這里對其操作要點(diǎn)作一下簡單介紹：

1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。

薄層色譜用于定量時，點(diǎn)樣是最主要的誤差來源。

供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開，3

2.薄層層析法具體操作注意事項(xiàng)是什么?

鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。

勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。

勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。

通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。 點(diǎn)樣 盡量用小的點(diǎn)樣管。

如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。 這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。

樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。

點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。 展開劑配制 選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。

絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑。混合不均勻和沒有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。

各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。 展開系統(tǒng)的飽和 一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。

把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時間在半個小時左右。

展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動作應(yīng)該盡量輕、快。 溫濕度的控制 溫濕度對薄層影響都很大。

不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。

溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 顯色 噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。

3.色譜分離技術(shù)中,薄層色譜的基本操作過程及注意事項(xiàng)

薄層色譜操作注意事項(xiàng)

影響薄層色譜分析的因素有很多，比如樣品處理方法、薄層板制備技巧、點(diǎn)樣方法、展開劑的遴選、溫濕度的掌控等等很多方面，在這里對其操作要點(diǎn)作一下簡單介紹：

1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。

2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。

薄層色譜用于定量時，點(diǎn)樣是最主要的誤差來源。

供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開，Kaiser稱之為“上樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)。這種效應(yīng)對隨后的先行展開造成很不利的影響。

供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留，也會改變展開的選擇性，特別是供試液的溶劑與展開劑的極性相差較大時更明顯。再者，親水性溶劑殘留在原點(diǎn)吸收大氣中的水分（特別在高濕度環(huán)境）對色譜的影響也不可低估。因此點(diǎn)樣時的同步干燥或繼后干燥以除去原點(diǎn)殘存的溶劑是需要的。但應(yīng)盡可能避免高溫加熱，如用吹風(fēng)筒加熱，樣品變?yōu)楣虘B(tài)后，部分或全部強(qiáng)烈的吸附在吸附劑的顆粒上，而促進(jìn)了硅膠的有催化作用的活性表面故態(tài)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致樣品的變性（尤其熱不穩(wěn)定物質(zhì)），至少移動相在展開時對這部分樣品的溶解速度比移動速度慢得多而形成拖尾（斑點(diǎn)拖尾的原因之一）。

4.利用薄層色譜對藥物進(jìn)行鑒別和雜質(zhì)檢查時應(yīng)注意哪些操作事項(xiàng)

薄層色譜法（The layer chromatography,TLC）是將固定相均勻的涂布在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬板上形成薄層，在此薄層上進(jìn)行色譜分離的方法，它屬于平板色譜，是一種常用的色譜分離方法。

TLC法被許多國家藥典用于藥物中雜質(zhì)的檢查、藥物分析等方面，且是目前藥典中收載最多的鑒別與有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一，具有設(shè)備簡單、操作簡便、分離速度快，靈敏度和分辨率較高等優(yōu)點(diǎn)。

而薄層色譜在藥物分析中，則常用薄層色譜掃描法，其主要用于以下幾個方面：

1、中藥材與中成藥的鑒別與成分分析

2、合成藥物及其制劑分析

3、藥物代謝研究

4、抗菌素分析

5、中藥的TLC指紋圖譜鑒別

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來的一種高效、快速、高選擇性、高靈敏度的新型分離分析技術(shù)，是經(jīng)典液相色譜的發(fā)展。

高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用主要是鑒別相關(guān)物質(zhì)、檢查藥物中有關(guān)物質(zhì)的含量限度，測定有效成分或主要成分含量。

1、在藥物鑒別中的應(yīng)用

在HPLC法中，保留時間與組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，是定性的參數(shù)，可用于藥物的鑒別，在中國藥典中就有大量的藥物采用此法進(jìn)行鑒別。

2、在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用

歷年來各國藥典中收載了多種藥物采用HPLC法進(jìn)行雜質(zhì)檢查的方法，并且可采用HPLC法進(jìn)行雜質(zhì)檢查的藥物種類在逐年頒布的藥典中有所增加。

3、在含量測定中的應(yīng)用

用高效液相色譜法測定合成藥及其制劑的含量，可以消除藥物中的雜質(zhì)，制劑中的附加劑及共存藥物的干擾。

5.薄層色譜基本操作有哪幾個關(guān)鍵技術(shù) 各項(xiàng)操作應(yīng)該注意什么

薄層色譜（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固-液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外，在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，常利用薄層色譜觀察原料斑點(diǎn)的逐步消失來判斷反應(yīng)是否完成。

薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板（10*3cm左右）上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離頂端約1cm附近時，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。

注意事項(xiàng)：

1鋪制薄層板：鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1:2~3，硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。 2點(diǎn)樣：盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。 薄層色譜用于定量時，點(diǎn)樣是最主要的誤差來源。 供試液的溶劑均有不同程度的洗脫力，所以在點(diǎn)樣的同時，樣品在原點(diǎn)就可是成環(huán)形展開，原點(diǎn)直徑的擴(kuò)散促進(jìn)了這種展開，Kaiser稱之為“上樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)。這種效應(yīng)對隨后的先行展開造成很不利的影響。 供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留，也會改變展開的選擇性，特別是供試液的溶劑與展開劑的極性相差較大時更明顯。再者，親水性溶劑殘留在原點(diǎn)吸收大氣中的水分（特別在高濕度環(huán)境）對色譜的影響也不可低估。因此點(diǎn)樣時的同步干燥或繼后干燥以除去原點(diǎn)殘存的溶劑是需要的。但應(yīng)盡可能避免高溫加熱，如用吹風(fēng)筒加熱，樣品變?yōu)楣虘B(tài)后，部分或全部強(qiáng)烈的吸附在吸附劑的顆粒上，而促進(jìn)了硅膠的有催化作用的活性表面故態(tài)化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致樣品的變性（尤其熱不穩(wěn)定物質(zhì)），至少移動相在展開時對這部分樣品的溶解速度比移動速度慢得多而形成拖尾（斑點(diǎn)拖尾的原因之一）。

3 展開劑配制 選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑?；旌喜痪鶆蚝蜎]有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實(shí)驗(yàn)室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。 4 展開系統(tǒng)的飽和 一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時間在半個小時左右。展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動作應(yīng)該盡量輕、快。 5 溫濕度的控制 溫濕度對薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。 6 TLC通用顯色方法 通用顯色方法主要有： 1、紫外照射法：方便、不破壞樣品； 2、碘蒸氣法：通用性強(qiáng)，與紫外法結(jié)合靈敏度高于該兩法單獨(dú)使用； 3、熒光試劑：制造熒光背景，使原來紫外下無熒光物質(zhì)被鑒別，有熒光物質(zhì)更明顯； 4、硫酸溶劑：對絕大多數(shù)有機(jī)物有效，但有破壞性。