線粒體分離的(提取線粒體 及其葉綠體的注意事項(xiàng))

1.提取線粒體、及其葉綠體的注意事項(xiàng)

原理：分離要用的主要試劑是層析液。

層析液是一種脂溶性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑。葉綠體中的色素在層析液中的溶解度不同：溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得快；溶解度低的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得慢。

層析分離葉綠體中的色素：將紙條畫(huà)有濾液細(xì)線的一端置于燒杯中的層析液中，注意千萬(wàn)不要將濾液細(xì)線浸沒(méi)在層析液中，否則會(huì)使色素溶解而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。層析液是揮發(fā)性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，并且具有一定的毒性，所以在操作中要盡量用培養(yǎng)皿蓋住燒杯口。

觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果：最后濾紙條上將分離出四條色素帶，顏色從上往下分別是橙黃色、黃色、藍(lán)綠色和黃綠色，四種色素分別是胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。 ############################################################# 注意事項(xiàng)：1.減去角：為了盡量讓層析液在濾紙上的擴(kuò)散速度相等2.加入二氧化硅：為了研磨的充分，加碳酸鈣是為了防止研磨時(shí)色素被破壞，加入丙烯來(lái)溶解色素。

3.加入酒精：因?yàn)槿~綠素溶于有機(jī)溶劑，所以要加酒精，就是用來(lái)溶解的?。。?.加入CaCo3：為了保護(hù)葉綠素分子不受損傷.葉綠素不穩(wěn)定的，容易被活細(xì)胞里的有機(jī)酸破壞（老師教我們記這點(diǎn)的時(shí)候說(shuō)：你們給我記住了！！"蓋世太保"（"鈣是太保"）保護(hù)葉綠素啊..汗汗。

） Principle:Separation of the main reagent is to use liquid chromatography. Liquid chromatography is a kind of fat-soluble strong organic solvent. The chloroplasts pigment in liquid chromatography the solubility of different: high solubility with liquid chromatography in the filter paper spread fast; Low solubility with liquid chromatography in the filter paper spread slowly.Chromatography separation in the chloroplasts pigment: will note the picture has filtrate fine line end in beaker of chromatography liquid, pay attention to don't will filtrate fine wire submerged in liquid chromatography, or you will make pigment solution and lead to test failure. Liquid chromatography is volatile strong organic solvents, and has certain toxicity, so in the operation to try to use petri dish cover glass mouth.To observe the experimental results: the article filter paper will separate the four pigment belt, color from up to down respectively is orange, yellow, turquoise and kelly, four kinds of pigment were carotene, lutein, chlorophyll a and chlorophyll b.# # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # Note:1. Minus the Angle:In order to try to get chromatography liquid in the filter paper on the diffusion velocity equal2. Add silica:In order to fully grinding, add calcium carbonate is to prevent the grinding pigment is destroyed, join propylene to dissolve the pigment.3. Add alcohol:Because the chlorophyll soluble in organic solvents, so want to add alcohol, is used to dissolve!!4. Join CaCo3:In order to protect the chlorophyll molecule is not damaged.Chlorophyll is not stable, easy to live in the cells of organic acid damage(the teacher taught us to remember this: you give me remember!! "gestapo" (" calcium is boyz ") to protect the chlorophyll ah.. sweat | | | sweat。

2.如何分離細(xì)胞核與線粒體

如何分離細(xì)胞核與線粒體

細(xì)胞核與線粒體的分級(jí)分離

一、原理

細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。

分離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行分離，其過(guò)程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細(xì)胞成分的化學(xué)組成、理化特性及其功能的主要手段。

勻漿（Homogenization）低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)（即0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣）進(jìn)行破碎細(xì)胞使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。

分級(jí)分離（Fractionation）由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來(lái)，從而使各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開(kāi)始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沈淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。

分析 分級(jí)分離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。

二、細(xì)胞核的分離提取

（一）操作步驟

1.用頸椎脫位的方法處死小白鼠后，迅速剖開(kāi)腹部取出肝臟，剪成小塊（去除結(jié)締組織）盡快置于盛有0.9%NaCl的燒杯中，反復(fù)洗滌，盡量除去血污，用濾紙吸去表面的液體。

2.將濕重約1g的肝組織放在小平皿中，用量筒量取8ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣溶液，先加少量該溶液于平皿中，盡量剪碎肝組織后，再全部加入。

3.剪碎的肝組織倒入勻漿管中，使勻漿器下端浸入盛有冰塊的器皿中，左手持之，右手將勻漿搗桿垂直插入管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3~5次，用3層紗布過(guò)濾勻漿液于離心管中，然后制備一張涂片①，做好標(biāo)記，自然干燥。

4.將裝有濾液的離心管配平后，放入普通離心機(jī)，以2500rpm，離心15分鐘；（1）緩緩取上清液，移入高速離心管中，保存于有冰塊的燒杯中，待分離線粒體用；（2）同時(shí)涂一張上清液片②做好標(biāo)記，自然干燥；（3）余下的沉淀物進(jìn)行下一步驟。

5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣溶液懸浮沉淀物，以2500rpm離心15分鐘棄上清，將殘留液體用吸管吹打成懸液，滴一滴于干凈的載玻片上，涂片③，自然干燥。

6.將①、②、③涂片用l%甲苯胺蘭染色后蓋片即可觀察。

（二）結(jié)果

分別于高倍鏡下觀察三張涂片，描述鏡下所見(jiàn)。

三、高速離心分離提取線粒體

（一）操作步驟

1.將裝有上清液的高速離心管，從裝有冰塊的燒杯中取出，配平后，以17000rpm離心20分鐘，棄上清，留取沉淀物。

2.加入0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣液lml，用吸管吹打成懸液，以17000rpm離心20分鐘，將上清吸入另一試管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣溶液混勻成懸液（可用牙簽）。

3.取上清液和沉淀物懸液，分別滴一滴于干凈載玻片上（分別標(biāo)記④、⑤涂片），各滴一滴0.02%詹納斯綠B染液蓋上蓋片染20分鐘。

（二）結(jié)果

油鏡下觀察，顆粒狀的線粒體被詹納斯綠B染成藍(lán)綠色。

3.分離線粒體的時(shí)候?yàn)槭裁匆燃由僭S的介質(zhì)液

由于不同細(xì)胞器的密度不同，因此可以用差速離心法將不同細(xì)胞器進(jìn)行分離；線粒體進(jìn)行有氧呼吸的第二、第三階段，在線粒體中進(jìn)行反應(yīng)的物質(zhì)的丙酮酸，條件是由氧氣存在，且溫度、PH等條件適宜；線粒體內(nèi)膜向內(nèi)凹陷形成嵴進(jìn)而增大膜面積，因此將線粒體放入蒸餾水中線粒體會(huì)通過(guò)滲透作用吸水，由于線粒體內(nèi)膜有很多嵴，吸水后不易破裂，而外膜吸水膨脹，容易破裂，進(jìn)而將線粒體內(nèi)膜與外膜分開(kāi).

故答案為：

差速離心 丙酮酸 有氧氣存在、適宜溫度 蒸餾水（或低滲溶液） 線粒體會(huì)吸水膨脹，線粒體內(nèi)膜有很多嵴，吸水后不易破裂，而外膜吸水膨脹，容易破裂