pcr檢查(PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些)
1.PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些
1、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測(cè)人員必須通過(guò)國(guó)家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書(shū)；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴(kuò)展資料
PCR實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。
2、簡(jiǎn)便、快速：PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一般在2~4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。
參考資料來(lái)源：百度百科-PCR實(shí)驗(yàn)室
2.PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。
斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。
RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100~300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。
若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
3.在做pcr的操作過(guò)程中需注意哪些問(wèn)題?
首先，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，結(jié)構(gòu)要好，長(zhǎng)度應(yīng)在20bp左右，避免引物間形成引物二聚體。
兩條引物的退火溫度盡量保持一致，最好是在55度左右。其次，使用的DNA模板量是比較關(guān)鍵的，應(yīng)使用純度較高，基因組較完全，沒(méi)有產(chǎn)生斷鏈的基因組DNA。
然后是PCR體系中各個(gè)試劑的使用，比如說(shuō)酶的純度，活性，并且要注意酶量一定要適中，過(guò)尤不及。各DNTP的量要保持一致。
PCRbuffer中要注意有無(wú)添加鎂離子等幫助反應(yīng)進(jìn)行的東西。等等。
最后是PCR程序的設(shè)置。如果怕一開(kāi)始就使用一個(gè)固定的退火溫度擴(kuò)增不出來(lái)，可以先小批量得試驗(yàn)溫度梯度，或者用touchdown程序，即先設(shè)置一個(gè)較高的退火溫度，這樣引物的特異性結(jié)合會(huì)比較好，然后每個(gè)循環(huán)的退火溫度都比上個(gè)循環(huán)低0.5度或1度，最終停留在某一個(gè)較合適的溫度完成整個(gè)程序。
PCR反應(yīng)中有太多細(xì)節(jié)要注意了。只能在試驗(yàn)中摸索，進(jìn)步。
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4.PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短均會(huì)使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對(duì)，但末端沒(méi)有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計(jì)時(shí)可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過(guò)低會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)量，過(guò)高會(huì)增加引物二聚或錯(cuò)配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無(wú)3'-5'外切酶活性，因此對(duì)單核苷酸的錯(cuò)配無(wú)校正功能，發(fā)生堿基錯(cuò)配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯(cuò)配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為T(mén)aq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯(cuò)誤率） （數(shù)據(jù)來(lái)源：美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對(duì)Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過(guò)量能增加非特異擴(kuò)增。
4. dNTP的濃度過(guò)高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯(cuò)配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長(zhǎng)度，通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。
6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開(kāi)放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽(yáng)性和陰性對(duì)照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲(chǔ)存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
5.PCR的操作注意事項(xiàng)
PCR操作注意事項(xiàng)：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來(lái)，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。
2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī)，2600*g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1*106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤(pán)1-4μg，上皮細(xì)胞8-15μg，成纖維細(xì)胞5-7μg
6.進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)
首先，要確定你的模板DNA的濃度大概是多少，太稀和太濃都影響PCR結(jié)果，具體數(shù)據(jù)不記得了，只是我自己跑PCR時(shí)因?yàn)闈舛葐?wèn)題失敗了很多次，通過(guò)多次調(diào)整濃度才得到較理想的結(jié)果。
其次，如果是自己提的DNA，要確保模板中沒(méi)有酒精（提DNA最后一步，一定要等酒精揮發(fā)完才能加TE）
最重要的是要探索一個(gè)好的退火溫度，退火溫度的高低可以以0.5℃的梯度變化確定，假如參考值為61℃，先跑一次，看結(jié)果，如果拖尾很長(zhǎng)，則一個(gè)一個(gè)梯度增加退火溫度，但不能增得太急，我那時(shí)次增加5℃，結(jié)果跑出來(lái)全是很小很小的片段，大概都只有300bp了。
這是我跑PCR的一些經(jīng)驗(yàn)，僅供參考
7.PCR操作時(shí)注意事項(xiàng)
1. PCR引物設(shè)計(jì)： 引物設(shè)計(jì)可能是PCR擴(kuò)增成功最關(guān)鍵的因素。
如引物設(shè)計(jì)欠佳，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，甚至擴(kuò)增失敗，其原因是設(shè)計(jì)欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。 在引物設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素，其中最重要的是引物長(zhǎng)度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補(bǔ)問(wèn)題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3'-末端序列等。
（1）引物長(zhǎng)度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時(shí)間均至少部分與PCR引物長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)，因此引物長(zhǎng)度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長(zhǎng)度為15-30核苷酸。
（2）溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開(kāi)H鍵，使雙鏈DNA分開(kāi)或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。
Tm可采用下列公式計(jì)算：Tm=2(A+T) + 4(G+C)。 需注意PCR反應(yīng)至少有兩個(gè)（一對(duì)）引物，兩個(gè)寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近，不可差異過(guò)大。
因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時(shí)可發(fā)生錯(cuò)配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時(shí)則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。 （3）引物序列互補(bǔ)：設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)絕對(duì)沒(méi)有3個(gè)堿基以上的內(nèi)引物配對(duì)，如引物有這樣具有自我配對(duì)的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時(shí)。
（4）G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長(zhǎng)A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。
在選擇的引物序列中應(yīng)沒(méi)有多G 或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A 和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物-模板復(fù)合物展開(kāi)延伸，降低擴(kuò)增的效率。同時(shí)多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應(yīng)被避免。
（5）3'-末端序列：為控制引物錯(cuò)配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3'末端的位置。 總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)應(yīng)認(rèn)真小心。
對(duì)于一個(gè)成功的PCR來(lái)說(shuō)，幾個(gè)重要因素如引物長(zhǎng)度、GC含量和3'序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長(zhǎng)度約為20個(gè)堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。
分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時(shí)，應(yīng)考慮無(wú)單聚合體， 沒(méi)有明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒(méi)有明顯的同源性。為避免枯燥無(wú)味的設(shè)計(jì)，節(jié)省時(shí)間，減少錯(cuò)誤，可應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計(jì)、選擇、確定寡核苷酸引物。
