PRC擴增(我想問(wèn)做PCR擴增應該注意的事項?)
1.我想問(wèn)做PCR擴增應該注意的事項?
注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會(huì )有蛋白質(zhì)污染，影響比值 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 總mRNA的提取（自己的經(jīng)驗） 一、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑 1. Chloroform：氯仿 （分析純） 2. Isoproplyl alcohol：異丙醇（分析純） 3. 75% Ethanol(in DEPC-treated water):75%乙醇。
要求用分析純無(wú)水乙醇并用0.01%的DEPC處理過(guò)的無(wú)Rnase的水稀釋。 4. RNase-free water：無(wú)Rnase的水。
方法是：將DEPC按0.01%(V/V)加在d H2O中500ml(50ul)，在37℃過(guò)夜，并高壓滅菌即得（150℃ 3小時(shí)） 5. 一次性塑料手套 6. 注意：DEPC有致癌之嫌 二、關(guān)于Trizol Reagent的使用過(guò)程： 1. Homogenization（勻漿） a. Tissues：組織 每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過(guò)Trizol試劑的10%。 b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒后出現病變的） 針對JEV細胞總RNA的抽提法： BHK21細胞長(cháng)成單層后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。
出 現75%-100%的病變時(shí)，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩 種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿(mǎn)瓶 底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮） （1） 組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震蕩15s，置室溫2-3分鐘。 （3） 4℃離心，10000g*15min，離心后，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無(wú)色的水相。
RNA包含在水相中，水相的體積約相當于所加的Trizol試劑量的60%。 (4) 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇），置室溫10min。 (6) 4℃離心，10000g*10min。
RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。 （7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震蕩，充分洗滌沉淀，4℃離心，5500g*5min。
棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無(wú) Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鐘以溶解RNA,-70℃保存備用。 （8） 抽提出的細胞總RNA干燥后加水50ul，取10ul加無(wú)Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。
于0.5cm厚的石英比色杯中，以無(wú)Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio。
2.PCR擴增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過(guò)長(cháng)或過(guò)短均會(huì )使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒(méi)有嚴格的限制，故引物設計時(shí)可在5'末端加上限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過(guò)低會(huì )影響反應產(chǎn)量，過(guò)高會(huì )增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無(wú)3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無(wú)校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng )出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為T(mén)aq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數據來(lái)源：美國冷泉港實(shí)驗室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過(guò)量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過(guò)高會(huì )增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過(guò)低則會(huì )導致反應速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長(cháng)度，通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。
6. 減低污染的常規措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開(kāi)放置；②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區的獨立性；③使用陽(yáng)性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗的所有反應試劑；⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗前一定要認真清潔加樣器等。
3.在PCR擴增實(shí)驗中應注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為48h以?xún)龋行┳詈糜诋斎针娪緳z測，大于48h后帶型不規則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶 PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。
需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。
有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。 假陽(yáng)性 出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。
需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假陽(yáng)性。
這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用。必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現非特異性擴增帶 PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數 過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。
其對策有：必要時(shí)重新設計引 物。減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。
降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。
其對策有：減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數。
4.什么叫做prc擴增?
PCR是一種體外DNA 擴增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應的多次循環(huán)，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時(shí)間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。
在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于—個(gè)復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復雜群體中的特異微生物或某個(gè)基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個(gè)數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術(shù)常與其他技術(shù)結合起來(lái)使用， 如RT-PCR、競爭PCR、槽式PCR、RAPf）、ARDRA等。
RT-PCR不僅能檢測出不能培養微生物，還能測量mRNA基因的轉錄水平。
競爭性PCR是一種定量PCR，通過(guò)向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來(lái)確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。
將PCR技術(shù)和限制酶切技術(shù)結合使用，用限制酶酶切目的基因的PCR擴增產(chǎn)物，通過(guò)對酶切產(chǎn)物的分析，探測該基因的多態(tài)性。
RAPD(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)也是應用比較廣泛的一項技術(shù)。RAPD是用那些對某—特定基因的非特異性的引物來(lái)擴增某些片段。RAPD分析用于探測含有混合微生物種群的各種生物反應器中的微生物多樣性。用RAPD分析所得到的基因組指紋圖譜在比較一段時(shí)間內微生物種群的變化以及比較小試規模和中試規模的反應器方面是有用的，但還不足以用來(lái)估測群落的生物多樣性。
5.在PCR擴增實(shí)驗中應注意什么
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過(guò)長(cháng)或過(guò)短均會(huì )使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內部和引物之間不應含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區域的同源性應小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒(méi)有嚴格的限制，故引物設計時(shí)可在5'末端加上限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)和/或啟動(dòng)密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過(guò)低會(huì )影響反應產(chǎn)量，過(guò)高會(huì )增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無(wú)3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無(wú)校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。
Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng )出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數據顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為T(mén)aq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數據來(lái)源：美國冷泉港實(shí)驗室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結合，不同反應體系中應適當調整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過(guò)量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過(guò)高會(huì )增加堿基的錯誤摻入率，使反應特異性下降；過(guò)低則會(huì )導致反應速度下降。使用時(shí)4種dNTP必須以等當量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數中應特別注意復性溫度，它決定引物與模板的特異性結合。退火復性溫度可根據引物的長(cháng)度，通過(guò)Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。
在Tm允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結合。6. 減低污染的常規措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開(kāi)放置；②應保持樣品制備、PCR反應液配制與PCR產(chǎn)物分析三個(gè)工作區的獨立性；③使用陽(yáng)性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗的所有反應試劑；⑤配制好的PCR反應試劑應分成小包裝儲存，每個(gè)包裝僅用于單次實(shí)驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應液時(shí)必須戴手套；⑦實(shí)驗前一定要認真清潔加樣器等。
6.PCR加樣有什么需要注意的
實(shí)驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節都應該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(cháng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺，打開(kāi)反應管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；
5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；
6. 操作時(shí)設立陰陽(yáng)性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應該專(zhuān)用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區；
8. 重復實(shí)驗，驗證結果，慎下結論。
7.PCR實(shí)驗操作注意事項有哪些
1、必須在無(wú)菌無(wú)塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測人員必須通過(guò)國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓并取得合格證書(shū)；
3、必須擁有標準的的PCR熒光實(shí)驗室；
4、后PCR區PCR完成以后，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。
擴展資料
PCR實(shí)驗特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗產(chǎn)物的生成量是以指數方式增加的，能從100萬(wàn)個(gè)細胞中檢出一個(gè)靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個(gè)RFU；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細菌。
2、簡(jiǎn)便、快速：PCR實(shí)驗反應一般在2~4 小時(shí)完成擴增反應。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。
參考資料來(lái)源：百度百科-PCR實(shí)驗室
