蔗糖酶活力測定的(酶活力測定的注意事項有哪些)
1.酶活力測定的注意事項有哪些
注意事項：
1.底物濃度 除選擇適合的底物外，在實(shí)際應用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應速度V成雙曲線(xiàn)關(guān)系，在酶活性測定時(shí)，要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜，此時(shí)反應速度基本達到最大反應速度，測定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應條件一定時(shí)，酶濃度與反應速度成正比。按照中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，只有[S]>>[E]時(shí)，酶才能被底物分子飽和，反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過(guò)高時(shí)，應將標本適當稀釋后再加以測定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數酶的最適溫度在37~40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測定溫度尚未統一，但常規實(shí)驗室多使用37℃。溫度對酶促反應的影響程度通常用溫度系數（Q10）表示。溫度系數指溫度每升高10℃，化學(xué)反應速度增加的倍數。Q10通常為l~2。由溫度系數得知，溫度的變化對酶活性有著(zhù)重要影響，因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進(jìn)行，溫度波動(dòng)要控制在±1℃。
4.離子強度和pH值 在最適pH時(shí)，酶的活性最強，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數酶的最適pH在5~8之間。在測定酶活性時(shí)，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩定。血漿或血清標本含有多種緩沖溶質(zhì)，具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標本緩沖溶質(zhì)對反應液酸堿度的影響，使pH不致偏離設定值，標本用量不宜過(guò)大，血漿或血清標本體積/反應液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類(lèi)輔酶是結合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開(kāi)它們的輔基或輔酶就不能表現活性，因此在酶活性測定時(shí)，就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時(shí)才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時(shí)，也要滿(mǎn)足酶對激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類(lèi)藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬于競爭性抑制；哇巴因對Na+,K+-ATP酶的抑制屬于非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測定酶活性時(shí)，應避免抑制劑的影響。
綜上所述，測定酶活性時(shí)，最適條件的選擇應該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿(mǎn)足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
2.測定酶活性時(shí)應注意些什么?
酶的活性測定要求有適宜的特定反應條件，應注意影響酶促反應速度的各種因素應該相對恒定。
1.酶的樣品應做適當的處理。2.反應體系中，底物的量足夠使酶被底物飽和，以充分反映待測酶的活力。
但過(guò)高的底物濃度可能抑制酶的活性，一般底物濃度在10km以上。3.測定代謝物時(shí)應保持酶的足夠濃度。
4.應根據反應時(shí)間選擇反應的最適溫度。5.根據不同的底物和緩沖液選擇反應的最適pH。
6.為獲取最高反應速度，在反應體系中應含有適宜的輔助因子，激活劑等。7.測定酶活性時(shí)應測定酶促反應的初速度。
3.用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響中水平實(shí)驗結果是什么意思
需要，舉例說(shuō)明：正交實(shí)驗法舉例： 用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響 目的要求 1.初步掌握正交實(shí)驗設計方法的使用 2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值 實(shí)驗原理 酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應的速度。
通常是在其他因素恒定的條件下，通過(guò)對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡(jiǎn)單比較法。 本實(shí)驗用正交法測定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實(shí)驗方法。
正交法是通過(guò)正交表安排多因素實(shí)驗，利用統計數學(xué)原理進(jìn)行數據 分析的一種科學(xué)方法，它符合“以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信 息”的實(shí)驗設計原則。正交試驗法的程序為下列八個(gè)步驟： （1）確定試驗目的。
實(shí)驗目的是多種多樣的，如找出產(chǎn)品質(zhì)量指標的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實(shí)驗的目的是為了提高酶的反應速度，提高酶的活力。
（2）選擇質(zhì)量特性指標。應選擇能提高或改進(jìn)的質(zhì)量特性及因素效應。
對于本實(shí)驗來(lái)說(shuō)就是產(chǎn)物（葡萄糖）生成量的多少。 （3）選定相關(guān)因素。
即選擇和確定可能對實(shí)驗結果或質(zhì)量特性值有影響的那些因素，可人為控制與調節的因素，如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨立性。
（4）確定水平。水平，又稱(chēng)位級，是因素的一個(gè)給定值或一種特定的措施，或一種特定的狀態(tài)。
水平也就是因素變化的各種狀態(tài)。在確定水平時(shí)，應考慮選擇范圍、水平數和水平位置。
如本實(shí)驗的溫度水平可以選擇20℃、30 ℃、50 ℃三個(gè)水平。 （5）選用正交表。
應從因素數、水平數以及有無(wú)重點(diǎn)因素需要強化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下，首先根據水平數選用2或3系列表，然后，以容納試驗因素數，選用實(shí)驗次數最少的正交表。
如有重點(diǎn)考察的因素，則根據其多考察的水平數，選混合型正交表。 （6）配列因素水平，制定實(shí)驗方案。
按隨機原則，把因素配列于選用的正交表中，制定實(shí)驗的順序、時(shí)間等，即制定實(shí)驗具體方案。 （7）實(shí)施實(shí)驗方案。
按實(shí)驗方案，認真、正確地試驗，如實(shí)記錄各種實(shí)驗數據。 （8）實(shí)驗結果分析。
對實(shí)驗中取得的各種數據進(jìn)行分析。如從數據中直接選出符合或接近質(zhì)量特性期望值的實(shí)驗條件組。
如不能采用直觀(guān)分析方法，則應采用其他分析方法，確定各因素主次地位可用極差分析方法，定量分析各個(gè)因素對實(shí)驗結果的影響程度，則用方差分析方法。 操作方法 1.實(shí)驗設計： 1）確定指標：即實(shí)驗的結果。
本實(shí)驗的指標是酶活力。這里，用A520值表示。
2）制定因素水平表：考察四個(gè)因素（溫度、pH值、底物濃度和酶濃度），每個(gè)因素取三個(gè)水平（如溫度選擇20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三個(gè)水平）。水平是因素變化的范圍（通常是根據專(zhuān)業(yè)知識確定。
如無(wú)資料可借鑒，應先加寬范圍再逐步縮小）內要進(jìn)行實(shí)驗的具體條件，如表1。 表1 因素水平表 3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9(34)、L27(313)、L18(36*6)和L27(38*9)。
本實(shí)驗不考察各因素間的交互作用，也沒(méi)設計混合水平，只有水平數均為3的的四個(gè)因素，故選用L9(34)表，見(jiàn)表2。 分析： A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏； B. 判斷各因素顯著(zhù)性大小的順序； C. 判斷實(shí)驗結果的置信度。
實(shí)驗安排 具體操作步驟： 1、將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于試管中。 2、將酶粉用蒸餾水溶解（適當體積10-30ml不等），離心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活預示實(shí)驗，確定酶的稀釋倍數。（可根據產(chǎn)物稀釋的 倍數來(lái)確定酶的稀釋倍數）A520在0.4-2.0之間即可。
4、準備10支試管。其中一支為“0”號管，作為測量時(shí)的參 比溶液。
其他九支試管根據前面的圖表3加入相關(guān)的溶 液，分別在不同的條件下進(jìn)行酶反應。利用二硝基水楊酸 的方法測定不同管在A(yíng)520下的光密度值。
5、計算同一因素不同水平的級差，級差小代表離散度小， 表示該水平為酶反應的最適條件。 1）數據記錄：將上述兩組平行實(shí)驗的結果取平均值后的9個(gè)數據，填入表4中的Yi項內。
2）數據整理及分析：對于一般的實(shí)驗，可用極差分析，該分析方法簡(jiǎn)單、直觀(guān)。對要求精細的實(shí)驗，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計，但有一定的計算量。
對于有混合水平的正交實(shí)驗，只能用方差分析。
4.影響酶活性的因素實(shí)驗應注意什么
(1)酶促反應過(guò)程中，只有最初一段時(shí)間內反應速度與酶濃度成正比，隨著(zhù)反應時(shí)間的延長(cháng)，反應速度即逐漸降低。
(2)要規定一定的反應條件，如時(shí)間、溫度、pH等，并在酶測定過(guò)程中保持這些反應條件的恒定，如溫度不得超過(guò)規定溫度的士1℃，pH應恒定。
(3)配制的底物濃度應準確且足夠大，底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)標本要新鮮，由于絕大多數酶可因久置而活力降低，標本如無(wú)法及時(shí)測定，應保存于冰箱中。用血漿時(shí)，應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。有些酶在血細胞、血小板中的濃度比血清高，為此在采血、分離血清時(shí)，應注意防止溶血和白細胞的破裂。
(5)在測定過(guò)程中，所用儀器應絕對清潔，不應含有酶的抑制物，如酸、堿、蛋白沉淀劑等。
