細胞成分或結構分離中的保護方法(細胞組分的分級分離時(shí)分離的方法有幾種)
1.細胞組分的分級分離時(shí)分離的方法有幾種
試想一下，若沒(méi)有各種方法來(lái)分離組成細胞的不同區室和組分，那么現代生物學(xué)將困難重重。
從細胞信號通路 到新陳代謝，人們一直想知道，它們在哪兒，過(guò)去、現在及將來(lái)。賽默飛世爾科技 的市場(chǎng)部經(jīng)理Monica O'Hara Noonan介紹，研究人員對細胞進(jìn)行分級分離（fractionate）的原因有很多。
他們可能希望，當感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉位時(shí)，對其進(jìn)行追蹤。對細胞進(jìn)行分級分離能增強低豐度蛋白的檢測能力，或降低下游分析或功能分析的復雜性。
如果您正在從事這一方面的研究，請繼續往下讀。從細胞 上講，我們會(huì )幫助您將小麥和谷殼分開(kāi)。
細胞的組分 如何對細胞進(jìn)行分級分離取決于很多因素，包括哪些儀器 、知識可以利用，您想要分離什么，以及這些組分的下游應用是什么。離心是細胞分級分離中最常用的技術(shù)之一，它們單獨使用，或與其他方法結合。
例如，對于高爾基體 或過(guò)氧化物酶體，大部分操作都要求高速的密度梯度離心。然而，O'Hara Noonan也指出，超速離心也有一些缺點(diǎn)，包括超速離心機是高價(jià)的儀器，有些實(shí)驗室無(wú)法接觸到。
另外，密度梯度難以?xún)A倒是出了名的，其結果是技術(shù)依賴(lài)的。當然，其他的許多組分也可以只利用試劑和臺式儀器來(lái)富集。
供應商開(kāi)發(fā)出一些試劑盒，能方便快捷地帶來(lái)高度富集的細胞組分。賽默飛世爾 全新設計的Mem-PER Plus試劑盒，能在一小時(shí)之內富集完整的膜相關(guān)蛋白。
據sigma-aldrich 的產(chǎn)品專(zhuān)家Michael Moehlenbrock介紹，這類(lèi)試劑盒的原理在很大程度上是類(lèi)似的。它們往往使用低滲緩沖液給細胞膜帶來(lái)壓力，然后用等滲的提取緩沖液（帶或不帶還原劑和蛋白酶抑制劑）來(lái)維持感興趣的細胞器。
有時(shí)也需要機械裂解或去污劑裂解。“各個(gè)不同供應商在細胞分級分離試劑盒的設計上都是一致的，而不同細胞組分的差異在于緩沖液組成、裂解試劑和離心速度，”Moehlenbrock說(shuō)。
此類(lèi)試劑盒的價(jià)值并不在于某些秘密試劑，而在于QC系統的一致性和重復性。“細胞分級分離的方法已經(jīng)過(guò)充分鑒定，其操作步驟適用于大部分應用，”Moehlenbrock說(shuō)。
“商業(yè)化試劑盒為最終用戶(hù)帶來(lái)了簡(jiǎn)便和效率，同時(shí)提供了品質(zhì)保證的安全性。” 通過(guò)改變穿插在離心步驟之間的緩沖液的去污劑組分，研究人員可分離不止一個(gè)組分。
例如，市場(chǎng)上許多試劑盒可收集細胞核和胞漿蛋白。其他試劑盒也帶來(lái)了三個(gè)或四個(gè)不同的組分。
Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit產(chǎn)生了細胞質(zhì)、細胞膜/細胞器以及細胞核/細胞骨架組分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分離出細胞質(zhì)、細胞膜、細胞核和細胞骨架組分。美天旎提供一種不含去污劑的試劑盒，它利用TOM22抗體標記的磁珠來(lái)特異分離線(xiàn)粒體。
據該公司的技術(shù)支持介紹，他們不提供其他亞細胞組分的產(chǎn)品，但客戶(hù)可以利用自己的抗體來(lái)間接分離其他組分。同樣地，賽默飛世爾的Cell Surface Protein Isolation Kit標記細胞表面蛋白的外部賴(lài)氨酸，它具有一個(gè)可切割的生物素衍生物，讓此蛋白組分在細胞裂解后可被捕獲。
其中有什么 在細胞組分被分離出來(lái)之后，必須驗證您的實(shí)驗，并確認這些組分確實(shí)包含了您要分離的。盡管這些試劑盒通常不包含區分各種組分的試劑，但許多會(huì )指出不同的看家基因，讓您用來(lái)確保質(zhì)量。
Moehlenbrock表示：“在某些情況下，我們會(huì )提供分析的建議。”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技術(shù)指南建議檢查細胞色素c氧化酶活性和檸檬酸合酶活性，以確認外膜和內膜的完整性。
Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作為分級分離試劑盒的伴隨產(chǎn)品。生產(chǎn)科學(xué)家Jim Cormier介紹，當您在運行Western時(shí)，您會(huì )得到一個(gè)量化值，哪些組分占多少。
Sampler Kit包含細胞質(zhì)MEK1/2、線(xiàn)粒體凋亡誘導因子（AIF）、組蛋白H3和細胞骨架波形蛋白的兔單克隆抗體，以及山羊抗兔IgG。研究人員也可利用試劑盒中的建議，或搜索文獻，組裝自己的Western blot或ELISA試劑盒。
不過(guò)Cormier也提醒，并非每個(gè)抗體都有著(zhù)它應有的特異性。下游的分析 與超速離心相比，基于試劑盒的細胞分級分離方法快速又方便，也適合多個(gè)下游應用，如EMSA、報告基因分析、酶活分析和Western blot。
然而，制備過(guò)程中所使用的去污劑和鹽可能阻礙蛋白質(zhì)組學(xué)的應用，如質(zhì)譜，“這有時(shí)取決于去污劑的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O'Hara Noonan說(shuō)。“在某些情況下，您可能需要透析或脫鹽。”
同樣地，有時(shí)可能需要額外的步驟，來(lái)增加產(chǎn)物的純度。在讀研究生時(shí)，Moehlenbrock一般使用臺式離心機來(lái)制備線(xiàn)粒體。
“有時(shí)我會(huì )用11,000 x g來(lái)去除細胞碎片。之后獲得線(xiàn)粒體提取物，并用蔗糖梯度和超速離心機來(lái)進(jìn)一步純化。
這取決于您想做什么，。
2.簡(jiǎn)述主要免疫細胞分離方法和分離原理
免疫磁珠法分離細胞原理：免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，無(wú)該種表面抗原的細胞由于不能與連接著(zhù)磁珠的特異性單抗結合而沒(méi)有磁性，不在磁場(chǎng)中停留，從而使細胞得以分離。
免疫磁珠法分為陽(yáng)性分離法和陰性分離法：陽(yáng)性分離法-磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞 陰性分離法-磁珠結合不需要的細胞，游離于磁場(chǎng)的細胞為所需細胞 一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽(yáng)性分離法的大，陽(yáng)性分離法用行更多。BD? Imag 磁珠：· 大小在0.1-0.45mm · 包被了BD Pharmingen生產(chǎn)的高質(zhì)量單抗 · 磁珠已為白細胞亞群的陽(yáng)性和陰性分離法所優(yōu)化 · 用于BD? IMagnet direct magnet 將包被了特異性單抗的BD IMag磁珠加入細胞懸液，磁珠特異性地與有相應抗原的細胞亞群結合，通過(guò)BD? IMagnet direct magnet分離得到的連有BD IMag磁珠的細胞可直接用于功能試驗和用流式細胞儀檢測。
缺點(diǎn)：? 對細胞造成機械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養 ? 純度低 ? 容易阻塞FCM的噴嘴 BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分離系統的優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出直徑約200nm中等大小磁珠。? 技術(shù)簡(jiǎn)單，分離在普通的試管中完成 ? 易于增大細胞用量 ? 對細胞溫和，不影響細胞功能及其分離后培養，可直接上流式 ? 純度高，回收率高 ? 成本低 此外，Mouse lineage panel中biotin標記的抗體還可用于FCM分析細胞表面抗原，以及進(jìn)行細胞/組織免疫熒光實(shí)驗。
BD提供2種免疫磁珠：· 包被了針對白細胞亞群的單抗的磁珠 · 包被了鏈霉親和素（streptavidin）的磁珠：此種情況下，在實(shí)驗系統中加入生物素標記的單抗，磁珠通過(guò)streptavidin與生物素標記的單抗結合，單抗與細胞表面相應抗原特異性結合而使細胞被磁珠間接捕獲，從而達到分離。這種磁珠使研究者可根據自己需要選擇生物素標記的各種單抗去分離目的細胞，應用范圍更廣泛，使用更靈活。
不同物種磁珠分離試劑 人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.? 利用Streptavidin連接的磁珠，只需選配biotin標記的所需單抗，就能分離更多種類(lèi)細胞 新貨聚焦：現在，BD PMG又推出用于分離小鼠造血干細胞/祖細胞的新試劑mouse lineage panel。其中包括5種biotin標記單抗，這些單抗能結合小鼠造血細胞的主要分化系細胞： T、B淋巴細胞，單核/巨噬細胞，粒細胞和紅細胞。
將這組試劑與Streptavidin Plus BD? IMag Particles (557812) 聯(lián)合使用，就能通過(guò)免疫磁性分離法去除小鼠骨髓造血細胞的主要分化系細胞，從而富集到造血干細胞和祖細胞（陰性片斷）。Mouse Lineage Panel(559971):(5*2ml/vial) 可分離109 Mouse骨髓細胞1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain);2) Biotin-anti-mouse CD11b;3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220;4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1);5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76) 磁分離細胞的重要指標是：純度和得率，這取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會(huì )影響細胞活性，也無(wú)法直接上流式。
目前市場(chǎng)上有2種磁性細胞分離系統：* Small particles （≈50 nm） - MACS* Large particles (1200~4500 nm) -others（如Dynal） 小磁珠 優(yōu)點(diǎn)：? 對細胞溫和，不影響分離細胞的后續培養 ? 可直接上流式檢測，不影響散射光 缺點(diǎn)：? 需要很強的磁場(chǎng)來(lái)分離細胞 ? 分離速度很慢，得率不高 ? 需要一次性的分離柱，不能在普通試管進(jìn)行 ? 成本昂貴 大磁珠 ? 技術(shù)簡(jiǎn)單，分離可在試管中完成 ? 易于增減細胞用量 ? 速度快，得率高 ? 成本低。
