細胞成分或結(jié)構(gòu)分離中的保護方法(細胞組分的分級分離時分離的方法有幾種)
1.細胞組分的分級分離時分離的方法有幾種
試想一下，若沒有各種方法來分離組成細胞的不同區(qū)室和組分，那么現(xiàn)代生物學(xué)將困難重重。
從細胞信號通路 到新陳代謝，人們一直想知道，它們在哪兒，過去、現(xiàn)在及將來。賽默飛世爾科技 的市場部經(jīng)理Monica O'Hara Noonan介紹，研究人員對細胞進行分級分離（fractionate）的原因有很多。
他們可能希望，當(dāng)感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉(zhuǎn)位時，對其進行追蹤。對細胞進行分級分離能增強低豐度蛋白的檢測能力，或降低下游分析或功能分析的復(fù)雜性。
如果您正在從事這一方面的研究，請繼續(xù)往下讀。從細胞 上講，我們會幫助您將小麥和谷殼分開。
細胞的組分 如何對細胞進行分級分離取決于很多因素，包括哪些儀器 、知識可以利用，您想要分離什么，以及這些組分的下游應(yīng)用是什么。離心是細胞分級分離中最常用的技術(shù)之一，它們單獨使用，或與其他方法結(jié)合。
例如，對于高爾基體 或過氧化物酶體，大部分操作都要求高速的密度梯度離心。然而，O'Hara Noonan也指出，超速離心也有一些缺點，包括超速離心機是高價的儀器，有些實驗室無法接觸到。
另外，密度梯度難以傾倒是出了名的，其結(jié)果是技術(shù)依賴的。當(dāng)然，其他的許多組分也可以只利用試劑和臺式儀器來富集。
供應(yīng)商開發(fā)出一些試劑盒，能方便快捷地帶來高度富集的細胞組分。賽默飛世爾 全新設(shè)計的Mem-PER Plus試劑盒，能在一小時之內(nèi)富集完整的膜相關(guān)蛋白。
據(jù)sigma-aldrich 的產(chǎn)品專家Michael Moehlenbrock介紹，這類試劑盒的原理在很大程度上是類似的。它們往往使用低滲緩沖液給細胞膜帶來壓力，然后用等滲的提取緩沖液（帶或不帶還原劑和蛋白酶抑制劑）來維持感興趣的細胞器。
有時也需要機械裂解或去污劑裂解。“各個不同供應(yīng)商在細胞分級分離試劑盒的設(shè)計上都是一致的，而不同細胞組分的差異在于緩沖液組成、裂解試劑和離心速度，”Moehlenbrock說。
此類試劑盒的價值并不在于某些秘密試劑，而在于QC系統(tǒng)的一致性和重復(fù)性?！凹毎旨壏蛛x的方法已經(jīng)過充分鑒定，其操作步驟適用于大部分應(yīng)用，”Moehlenbrock說。
“商業(yè)化試劑盒為最終用戶帶來了簡便和效率，同時提供了品質(zhì)保證的安全性。” 通過改變穿插在離心步驟之間的緩沖液的去污劑組分，研究人員可分離不止一個組分。
例如，市場上許多試劑盒可收集細胞核和胞漿蛋白。其他試劑盒也帶來了三個或四個不同的組分。
Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit產(chǎn)生了細胞質(zhì)、細胞膜/細胞器以及細胞核/細胞骨架組分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分離出細胞質(zhì)、細胞膜、細胞核和細胞骨架組分。美天旎提供一種不含去污劑的試劑盒，它利用TOM22抗體標(biāo)記的磁珠來特異分離線粒體。
據(jù)該公司的技術(shù)支持介紹，他們不提供其他亞細胞組分的產(chǎn)品，但客戶可以利用自己的抗體來間接分離其他組分。同樣地，賽默飛世爾的Cell Surface Protein Isolation Kit標(biāo)記細胞表面蛋白的外部賴氨酸，它具有一個可切割的生物素衍生物，讓此蛋白組分在細胞裂解后可被捕獲。
其中有什么 在細胞組分被分離出來之后，必須驗證您的實驗，并確認這些組分確實包含了您要分離的。盡管這些試劑盒通常不包含區(qū)分各種組分的試劑，但許多會指出不同的看家基因，讓您用來確保質(zhì)量。
Moehlenbrock表示：“在某些情況下，我們會提供分析的建議?！崩?，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技術(shù)指南建議檢查細胞色素c氧化酶活性和檸檬酸合酶活性，以確認外膜和內(nèi)膜的完整性。
Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作為分級分離試劑盒的伴隨產(chǎn)品。生產(chǎn)科學(xué)家Jim Cormier介紹，當(dāng)您在運行Western時，您會得到一個量化值，哪些組分占多少。
Sampler Kit包含細胞質(zhì)MEK1/2、線粒體凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、組蛋白H3和細胞骨架波形蛋白的兔單克隆抗體，以及山羊抗兔IgG。研究人員也可利用試劑盒中的建議，或搜索文獻，組裝自己的Western blot或ELISA試劑盒。
不過Cormier也提醒，并非每個抗體都有著它應(yīng)有的特異性。下游的分析 與超速離心相比，基于試劑盒的細胞分級分離方法快速又方便，也適合多個下游應(yīng)用，如EMSA、報告基因分析、酶活分析和Western blot。
然而，制備過程中所使用的去污劑和鹽可能阻礙蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，如質(zhì)譜，“這有時取決于去污劑的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O(jiān)'Hara Noonan說?！霸谀承┣闆r下，您可能需要透析或脫鹽?！?/p>
同樣地，有時可能需要額外的步驟，來增加產(chǎn)物的純度。在讀研究生時，Moehlenbrock一般使用臺式離心機來制備線粒體。
“有時我會用11,000 x g來去除細胞碎片。之后獲得線粒體提取物，并用蔗糖梯度和超速離心機來進一步純化。
這取決于您想做什么，。
2.簡述主要免疫細胞分離方法和分離原理
免疫磁珠法分離細胞原理：免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。
免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：陽性分離法-磁珠結(jié)合的細胞就是所要分離獲得的細胞 陰性分離法-磁珠結(jié)合不需要的細胞，游離于磁場的細胞為所需細胞 一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。BD? Imag 磁珠：· 大小在0.1-0.45mm · 包被了BD Pharmingen生產(chǎn)的高質(zhì)量單抗 · 磁珠已為白細胞亞群的陽性和陰性分離法所優(yōu)化 · 用于BD? IMagnet direct magnet 將包被了特異性單抗的BD IMag磁珠加入細胞懸液，磁珠特異性地與有相應(yīng)抗原的細胞亞群結(jié)合，通過BD? IMagnet direct magnet分離得到的連有BD IMag磁珠的細胞可直接用于功能試驗和用流式細胞儀檢測。
缺點：? 對細胞造成機械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng) ? 純度低 ? 容易阻塞FCM的噴嘴 BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分離系統(tǒng)的優(yōu)點，開發(fā)出直徑約200nm中等大小磁珠。? 技術(shù)簡單，分離在普通的試管中完成 ? 易于增大細胞用量 ? 對細胞溫和，不影響細胞功能及其分離后培養(yǎng)，可直接上流式 ? 純度高，回收率高 ? 成本低 此外，Mouse lineage panel中biotin標(biāo)記的抗體還可用于FCM分析細胞表面抗原，以及進行細胞/組織免疫熒光實驗。
BD提供2種免疫磁珠：· 包被了針對白細胞亞群的單抗的磁珠 · 包被了鏈霉親和素（streptavidin）的磁珠：此種情況下，在實驗系統(tǒng)中加入生物素標(biāo)記的單抗，磁珠通過streptavidin與生物素標(biāo)記的單抗結(jié)合，單抗與細胞表面相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而使細胞被磁珠間接捕獲，從而達到分離。這種磁珠使研究者可根據(jù)自己需要選擇生物素標(biāo)記的各種單抗去分離目的細胞，應(yīng)用范圍更廣泛，使用更靈活。
不同物種磁珠分離試劑 人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.? 利用Streptavidin連接的磁珠，只需選配biotin標(biāo)記的所需單抗，就能分離更多種類細胞 新貨聚焦：現(xiàn)在，BD PMG又推出用于分離小鼠造血干細胞/祖細胞的新試劑mouse lineage panel。其中包括5種biotin標(biāo)記單抗，這些單抗能結(jié)合小鼠造血細胞的主要分化系細胞： T、B淋巴細胞，單核/巨噬細胞，粒細胞和紅細胞。
將這組試劑與Streptavidin Plus BD? IMag Particles (557812) 聯(lián)合使用，就能通過免疫磁性分離法去除小鼠骨髓造血細胞的主要分化系細胞，從而富集到造血干細胞和祖細胞（陰性片斷）。Mouse Lineage Panel(559971):(5*2ml/vial) 可分離109 Mouse骨髓細胞1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain);2) Biotin-anti-mouse CD11b;3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220;4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1);5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76) 磁分離細胞的重要指標(biāo)是：純度和得率，這取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會影響細胞活性，也無法直接上流式。
目前市場上有2種磁性細胞分離系統(tǒng)：* Small particles （≈50 nm） - MACS* Large particles (1200~4500 nm) -others（如Dynal） 小磁珠 優(yōu)點：? 對細胞溫和，不影響分離細胞的后續(xù)培養(yǎng) ? 可直接上流式檢測，不影響散射光 缺點：? 需要很強的磁場來分離細胞 ? 分離速度很慢，得率不高 ? 需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行 ? 成本昂貴 大磁珠 ? 技術(shù)簡單，分離可在試管中完成 ? 易于增減細胞用量 ? 速度快，得率高 ? 成本低。
