分衍生化常用的反應有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等。
雖然氣相色譜已有許多衍生化方法,但它有一個(gè)致命的缺點(diǎn)是不能用于熱不穩定化合物。此外,對于一些有復雜基質(zhì)的實(shí)際樣品,除分離上的困難外,還容易污染進(jìn)樣器和損壞柱子。
衍生化反應從是否形成共價(jià)鍵來(lái)說(shuō),可分為兩種:標記和非標記反應。標記反應是在反應過(guò)程中,被分析物與標記試劑之間生成共價(jià)鍵;所有其它類(lèi)型的反應,如形成離子對、光解、氧化還原、電化學(xué)反應等都是非標記反應。
另一種區分衍生化反應是從衍生反應的場(chǎng)所來(lái)分,有柱前衍生化(pre-columnderivatization),柱上衍生化(on-columnderivatization)和柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。從是否與儀器聯(lián)機的角度來(lái)分有:在線(xiàn)(on-line)、離線(xiàn)(off-1ine)和旁線(xiàn)(at-line)(自動(dòng)化)三種。
目前在HPLC中以離線(xiàn)的柱前衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱前衍生法)與在線(xiàn)的柱后衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱后衍生法)使用居多,旁線(xiàn)衍生化方法是發(fā)展方向。柱前衍生法和柱后衍生法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。
柱前衍生法的優(yōu)點(diǎn)是:相對自由地選擇反應條件;不存在反應動(dòng)力學(xué)的限制;衍生化的副產(chǎn)物可進(jìn)行預處理以降低或消除其干擾;容易允許多步反應的進(jìn)行;有較多的衍生化試劑可選擇;不需要復雜的儀器設備。缺點(diǎn)是:形成的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成較大困難;在衍生化過(guò)程中,容易引入雜質(zhì)或干擾峰,或使樣品損失。
柱后衍生法的優(yōu)點(diǎn)有:(1)形成副產(chǎn)物不重要,反應不需要完全,產(chǎn)物也不需要高的穩定性,只需要有好的重復性即可;(2)被分析物可以在其原有的形式下進(jìn)行分離,容易選用已有的分析方法。缺點(diǎn)是:(1)對于一定的溶劑和有限的反應時(shí)間來(lái)說(shuō),目前只有有限的反應可供選擇;(2)需要額外的設備,反應器可造成峰展寬,降低分辨率。
1.硅烷化衍生化方法 硅烷化衍生化方法是氣相色譜樣品處理中應用最多的方法,它是利用質(zhì)子性化合物(如醇,酚,酸,胺,硫醇等)與硅烷化試劑反應,形成揮發(fā)性的硅烷衍生物。
硅烷化反應一般在數分鐘內即可完成。 能進(jìn)行硅烷化的化合物反應活性一般為:醇>酚>羧酸>胺>酰胺,反應活性還受空間位阻的影響,其醇的反應活性為伯醇>仲醇>叔醇,胺的反應活性為:伯胺>仲胺。
2. 酯化衍生化方法 有機酸由于極性較強,易產(chǎn)生嚴重的拖尾現象,而且大多數有機酸揮發(fā)性差,熱穩定性也較低。因此,許多有機酸(特別是長(cháng)碳鏈的有機酸)在進(jìn)行氣相色譜分析之前都要衍生為相應的酯。
常用的酯化方法有以下一些。 (1)甲醇法。
有機酸與甲醇在催化劑的存在下加熱,可以發(fā)生酯化反應,生成有機酸的甲酯。當催化劑使用H2SO4、HCl時(shí),需要回流,反應時(shí)間較長(cháng)。
若用三氟化硼作催化劑,反應可在室溫下完成,通常是將三氟化硼通入甲醇中配制酯化劑,然后再進(jìn)行酯化反應。 (2)重氮甲烷法。
重氮甲烷可與有機酸反應,生成有機酸的甲酯,放出氮氣。 此方法簡(jiǎn)便有效,反應速度快,轉化率高,很少有副反應,不引入雜質(zhì),但反應要在非水介質(zhì)中進(jìn)行。
反應條件雖溫和,但重氮甲烷不穩定,有爆炸性,有毒(致癌),制備和使用時(shí)要特別小心。常溫下酚羥基可與重氮甲烷緩慢反應,但在0℃以下時(shí)可避免酚羥基反應。
(3)三氟乙酸酐法。在三氟乙酸酐的存在下有機酸和酸可以反應生成酯。
此法特別適于空間位阻較大的有機酸和醇或酚的酯化。 (4)其他酯化方法。
為了提高方法的靈敏度和選擇性,有時(shí)需要制備甲酯以外的酯,這些酯化方法有的類(lèi)似于甲酯化反應,如以重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯代替重氮甲烷,可制得相應的酯。而且這些試劑穩定性好、爆炸性小。
用BF3的丙醇、丁醇或戊醇溶液與有機酸反應,也可制備相應的丙酯、丁酯或戊酯。 3. 酰化衍生化方法 酰化能降低羥基、氨基、巰基的極性,改善這些化合物的色譜性能(減少峰的拖尾),并能提高這些化合物的揮發(fā)性,也能增加某些易氧化化合物(如兒茶酚胺)的穩定性。
當酰化時(shí)引入含有鹵離子的酰基時(shí),還可提高使用電子捕獲檢測器(ECD)的靈敏度。常用的酰化試劑有酰鹵、酸酐和反應活性的酰化物(如乙酸咪唑)。
常用的酰化方法有以下一些。 (1)乙酰化法。
標準的乙酰化法是將樣品溶于氯仿(5ml)中,與0.5ml 乙酸酐和1ml乙酸在5℃反應2-6h,真空除去剩余試劑。還可以乙酸鈉為堿性催化劑,以乙酸酐為乙酰化試劑進(jìn)行乙酰化反應,用于糖類(lèi)的分析。
吡啶、三乙胺、甲基咪唑等也可作為堿性催化劑。乙酰化反應通常在非水介質(zhì)中進(jìn)行,但胺類(lèi)和酚類(lèi)化合物乙酰化時(shí)可在水溶液中進(jìn)行。
(2)多氟酰化法。常用的多氟酰化試劑是三氟乙酰(TFA),五氟丙酰(PFP)和七氟丁酰(HFB),其反應活性是TFA>PFP>HFB。
TFA和PFP的衍生物揮發(fā)性較強,而HFP的衍生物ECD靈敏度高。多氟酰化反應的時(shí)間除取決于多氟酰化試劑的活性外,還取決于目標化合物的活性。
如:麻黃堿和偽麻黃堿及其同系物與三氟乙酸酐(TFAA)在60℃時(shí)5min可完成反應:三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物與七氟乙酸酐(HFBA)在60℃時(shí)10min 可完成反應:而哌可酸,脯氨酸,谷氨酸,γ - 氨基丁酸的甲酯與HFBA的反應需在120℃時(shí)+20min 完成。多數情況氟酰化反應不需溶劑,但也有些需在溶劑中進(jìn)行。
此外,有時(shí)還需加堿性催化劑。如胺和酸的多氟酰化常以苯為溶劑,三乙胺為催化劑;糖類(lèi)的三氟乙酰化是在三氯甲烷溶劑中,以吡啶為催化劑進(jìn)行的。
4. 鹵化衍生化方法 在目標化合物中引入鹵原子后可使用ECD檢測器,提高檢測的靈敏度(降低檢測限),同時(shí)也可改善揮發(fā)性和穩定性,常用的鹵化衍生化方法有以下一些。 (1)鹵素法。
用鹵素直接作為衍生化試劑處理樣品,鹵素的作用是加成或取代。 (2)鹵化氫法。
常用HCl和HBr為衍生化試劑與不飽和鏈發(fā)生加成反應或與羥基發(fā)生置換反應。 (3)N - 溴代丁二酰亞胺(NBS 法)。
NBS是選擇性很強的鹵化衍生試劑,可使烯丙位的氫原子發(fā)生溴代反應。
1.硅烷化衍生化方法
硅烷化衍生化方法是氣相色譜樣品處理中應用最多的方法,它是利用質(zhì)子性化合物(如醇,酚,酸,胺,硫醇等)與硅烷化試劑反應,形成揮發(fā)性的硅烷衍生物。硅烷化反應一般在數分鐘內即可完成。
能進(jìn)行硅烷化的化合物反應活性一般為:醇>;酚>;羧酸>;胺>;酰胺,反應活性還受空間位阻的影響,其醇的反應活性為伯醇>;仲醇>;叔醇,胺的反應活性為:伯胺>;仲胺。
2. 酯化衍生化方法
有機酸由于極性較強,易產(chǎn)生嚴重的拖尾現象,而且大多數有機酸揮發(fā)性差,熱穩定性也較低。因此,許多有機酸(特別是長(cháng)碳鏈的有機酸)在進(jìn)行氣相色譜分析之前都要衍生為相應的酯。常用的酯化方法有以下一些。
(1)甲醇法。有機酸與甲醇在催化劑的存在下加熱,可以發(fā)生酯化反應,生成有機酸的甲酯。當催化劑使用H2SO4、HCl時(shí),需要回流,反應時(shí)間較長(cháng)。若用三氟化硼作催化劑,反應可在室溫下完成,通常是將三氟化硼通入甲醇中配制酯化劑,然后再進(jìn)行酯化反應。
(2)重氮甲烷法。重氮甲烷可與有機酸反應,生成有機酸的甲酯,放出氮氣。
此方法簡(jiǎn)便有效,反應速度快,轉化率高,很少有副反應,不引入雜質(zhì),但反應要在非水介質(zhì)中進(jìn)行。反應條件雖溫和,但重氮甲烷不穩定,有爆炸性,有毒(致癌),制備和使用時(shí)要特別小心。常溫下酚羥基可與重氮甲烷緩慢反應,但在0℃以下時(shí)可避免酚羥基反應。
(3)三氟乙酸酐法。在三氟乙酸酐的存在下有機酸和酸可以反應生成酯。此法特別適于空間位阻較大的有機酸和醇或酚的酯化。
(4)其他酯化方法。為了提高方法的靈敏度和選擇性,有時(shí)需要制備甲酯以外的酯,這些酯化方法有的類(lèi)似于甲酯化反應,如以重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯代替重氮甲烷,可制得相應的酯。而且這些試劑穩定性好、爆炸性小。用BF3的丙醇、丁醇或戊醇溶液與有機酸反應,也可制備相應的丙酯、丁酯或戊酯。
3. 酰化衍生化方法
酰化能降低羥基、氨基、巰基的極性,改善這些化合物的色譜性能(減少峰的拖尾),并能提高這些化合物的揮發(fā)性,也能增加某些易氧化化合物(如兒茶酚胺)的穩定性。當酰化時(shí)引入含有鹵離子的酰基時(shí),還可提高使用電子捕獲檢測器(ECD)的靈敏度。常用的酰化試劑有酰鹵、酸酐和反應活性的酰化物(如乙酸咪唑)。
常用的酰化方法有以下一些。
(1)乙酰化法。標準的乙酰化法是將樣品溶于氯仿(5ml)中,與0.5ml 乙酸酐和1ml乙酸在5℃反應2-6h,真空除去剩余試劑。還可以乙酸鈉為堿性催化劑,以乙酸酐為乙酰化試劑進(jìn)行乙酰化反應,用于糖類(lèi)的分析。吡啶、三乙胺、甲基咪唑等也可作為堿性催化劑。乙酰化反應通常在非水介質(zhì)中進(jìn)行,但胺類(lèi)和酚類(lèi)化合物乙酰化時(shí)可在水溶液中進(jìn)行。
(2)多氟酰化法。常用的多氟酰化試劑是三氟乙酰(TFA),五氟丙酰(PFP)和七氟丁酰(HFB),其反應活性是TFA>PFP>HFB。TFA和PFP的衍生物揮發(fā)性較強,而HFP的衍生物ECD靈敏度高。多氟酰化反應的時(shí)間除取決于多氟酰化試劑的活性外,還取決于目標化合物的活性。如:麻黃堿和偽麻黃堿及其同系物與三氟乙酸酐(TFAA)在60℃時(shí)5min可完成反應:三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物與七氟乙酸酐(HFBA)在60℃時(shí)10min 可完成反應:而哌可酸,脯氨酸,谷氨酸,γ - 氨基丁酸的甲酯與HFBA的反應需在120℃時(shí)+20min 完成。多數情況氟酰化反應不需溶劑,但也有些需在溶劑中進(jìn)行。此外,有時(shí)還需加堿性催化劑。如胺和酸的多氟酰化常以苯為溶劑,三乙胺為催化劑;糖類(lèi)的三氟乙酰化是在三氯甲烷溶劑中,以吡啶為催化劑進(jìn)行的。
4. 鹵化衍生化方法
在目標化合物中引入鹵原子后可使用ECD檢測器,提高檢測的靈敏度(降低檢測限),同時(shí)也可改善揮發(fā)性和穩定性,常用的鹵化衍生化方法有以下一些。
(1)鹵素法。用鹵素直接作為衍生化試劑處理樣品,鹵素的作用是加成或取代。
(2)鹵化氫法。常用HCl和HBr為衍生化試劑與不飽和鏈發(fā)生加成反應或與羥基發(fā)生置換反應。
(3)N - 溴代丁二酰亞胺(NBS 法)。NBS是選擇性很強的鹵化衍生試劑,可使烯丙位的氫原子發(fā)生溴代反應。
(1)硅烷化柱前衍生氣相色譜法測定氯霉素殘留:樣品經(jīng)提取,濃縮凈化、微氮吹干后,加入100μL硅烷化試劑,經(jīng)60℃30min反應。氯霉素的沸點(diǎn)降至可供氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用儀分析用。采用DB-35MS(30m*0.25mm*0.25µm)色譜柱。
(2)氧化鉛后柱衍生—HPLC法測定孔雀石綠殘留:孔雀石綠(malachite green,MG)屬于三苯甲烷類(lèi)染料。無(wú)色的母體形式(leuco malachite green,LMG)是孔雀石綠在魚(yú)體及其他生物體內的主要代謝產(chǎn)物和存在形式,在檢測孔雀石綠在魚(yú)體內的殘留,應同時(shí)檢測MG與LMG。采用C18柱色譜柱(250*4.6mm I.D.,5μm)和Celite 545氧化鉛后柱(純PbO2(1:1),20mm*2.1mm I.D)。結果在MG、LMG與結晶紫(GV)、母體結晶紫同時(shí)檢測時(shí),保留時(shí)間分別為:MG 8.33min、GV 14.18min、LMG 18.19min和19.84min。使用氧化鉛后柱衍生—HPLC法測定孔雀石綠殘留,具有分離效率高、快速、重現性好、儀器設備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),是MG、LMG檢測中最常用的方法。
分衍生化常用的反應有酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等。雖然氣相色譜已有許多衍生化方法,但它有一個(gè)致命的缺點(diǎn)是不能用于熱不穩定化合物。此外,對于一些有復雜基質(zhì)的實(shí)際樣品,除分離上的困難外,還容易污染進(jìn)樣器和損壞柱子。
衍生化反應從是否形成共價(jià)鍵來(lái)說(shuō),可分為兩種:標記和非標記反應。標記反應是在反應過(guò)程中,被分析物與標記試劑之間生成共價(jià)鍵;所有其它類(lèi)型的反應,如形成離子對、光解、氧化還原、電化學(xué)反應等都是非標記反應。另一種區分衍生化反應是從衍生反應的場(chǎng)所來(lái)分,有柱前衍生化(pre-columnderivatization),柱上衍生化(on-columnderivatization)和柱后衍生化(post-columnderivatization)三種。從是否與儀器聯(lián)機的角度來(lái)分有:在線(xiàn)(on-line)、離線(xiàn)(off-1ine)和旁線(xiàn)(at-line)(自動(dòng)化)三種。目前在HPLC中以離線(xiàn)的柱前衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱前衍生法)與在線(xiàn)的柱后衍生法(簡(jiǎn)稱(chēng)柱后衍生法)使用居多,旁線(xiàn)衍生化方法是發(fā)展方向。
柱前衍生法和柱后衍生法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。柱前衍生法的優(yōu)點(diǎn)是:相對自由地選擇反應條件;不存在反應動(dòng)力學(xué)的限制;衍生化的副產(chǎn)物可進(jìn)行預處理以降低或消除其干擾;容易允許多步反應的進(jìn)行;有較多的衍生化試劑可選擇;不需要復雜的儀器設備。缺點(diǎn)是:形成的副產(chǎn)物可能對色譜分離造成較大困難;在衍生化過(guò)程中,容易引入雜質(zhì)或干擾峰,或使樣品損失。柱后衍生法的優(yōu)點(diǎn)有:(1)形成副產(chǎn)物不重要,反應不需要完全,產(chǎn)物也不需要高的穩定性,只需要有好的重復性即可;(2)被分析物可以在其原有的形式下進(jìn)行分離,容易選用已有的分析方法。缺點(diǎn)是:(1)對于一定的溶劑和有限的反應時(shí)間來(lái)說(shuō),目前只有有限的反應可供選擇;(2)需要額外的設備,反應器可造成峰展寬,降低分辨率。
衍生化試劑很多,簡(jiǎn)單的說(shuō):它能幫你將不能分析的樣品通過(guò)衍生化試劑反應轉化為可分析的化合物.衍生化試劑比如有:烷基化試劑、硅烷化試劑、酰化試劑類(lèi)、熒光衍生化試劑、紫外衍生化試劑、苯甲酰氯衍生化試劑、羥基衍生化試劑 、手性衍生化試劑、氨基衍生化試劑、氣相色譜和液相色譜中常用的柱前衍生化方法、固相化學(xué)衍生化法。
高效液相色譜法有甲醛與2,4-二硝基苯肼(DNPH)反應生成腙,衍生化產(chǎn)物醛腙用有機溶劑萃取富集后,在一定溫度下蒸發(fā)、濃縮,再以甲醇或乙腈溶解或稀釋?zhuān)詈筮M(jìn)行色譜測定。雖然已有許多的衍生化試劑被使用,但是目前開(kāi)發(fā)新的衍生化試劑仍然是一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域,其主要目的是不斷提高靈敏度和選擇性以及擴大應用范圍。
衍生化試劑要求:①衍生劑必須過(guò)量且穩定;不過(guò)量反應不完全,檢測不充分。不穩定,重現性差;②衍生物、衍生產(chǎn)物和衍生副產(chǎn)物至少是好分離的。
當然如果只能檢測到衍生產(chǎn)物最好;③衍生反快速完全。反應慢,柱前衍生還可以,但柱后不行。
因為流速固定,衍生池管路長(cháng)度一定,留給衍生化的時(shí)間是一定的。柱前衍生可以在系統外等衍生完畢后進(jìn)樣,但也是影響效率的。
硅烷基指三甲基硅烷Si(CH3)3或稱(chēng)TMS。硅烷化作用是指將硅烷基引入到分了中,一般是取代活性氫。
活性氫被硅烷基取代后降低了化合物的極性,減少了氫鍵束縛。因此所形成的硅烷化衍生物更容易揮發(fā)。
同時(shí),由于含活性氫的反應位點(diǎn)數目減少,化合物的穩定性也得以加強。硅烷化化合物極性減弱,被測能力增強,熱穩定性提高。
硅烷化在GC分析中用途最大。許多被認為是不揮發(fā)性的或是在200~300℃熱不穩定的羥基化合物經(jīng)過(guò)硅烷化后成功的進(jìn)行色譜分析。
硅烷化試劑作用同時(shí)受到溶劑系統和添加的催化劑的影響。催化劑的使用(如三甲基氯硅烷,吡啶)可加快硅烷化試劑的反應。
確定好硅烷化反應的時(shí)間和溫度至關(guān)重要。必須知道衍生化的轉化速率,以實(shí)現對未知樣品的定最分析。
硅烷化試劑一般都對潮氣敏感,應密封保存以防止其吸潮失效。這些硅烷化試劑適用于范圍較廣,但如果使用過(guò)最,則可能給火焰離子化檢測器造成些麻煩。
三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化基團。引入此基團可改善色譜分離,并使得特殊檢測技術(shù)的應用成為可能。
硅烷化試劑還可以用于對玻璃器具(如GC的內襯管)和色譜的擔體進(jìn)行去活化。硅烷化試劑主要是(氯)甲基硅烷系列。
見(jiàn)下:雙(三甲基硅烷基)乙酰胺——(BSA)N,O-二(三甲基硅烷)乙酰胺——(BSA)雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺——(BSTFA)二甲基二氧硅烷——(DMDCS)六甲基二硅胺——(HMDS)1,1,1,3,3,3六甲基硅氮烷——(HMDS)N-(叔丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA)N-甲基三氟乙酰胺——(MTBSTFA)三氟乙酸——(TFA)三甲基氯硅烷——(TMCS)三甲基硅烷咪唑——(TMSI)二甲基二氯硅烷——(DMDCS)N-甲基-n-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA) 酰化作用作為硅烷化的代替方法,可通過(guò)羧酸或共衍生物的作用將含有活潑氫合物(如-OH、-SH、-NH)轉化為酯、硫酯或酰胺。含有鹵離了的羰基基團可增強電了捕獲檢測器酞化作用具有很多優(yōu)點(diǎn):保護不穩定基團,從而增加了化合物的穩定性;可提高如糖類(lèi),氨基酸等物質(zhì)的揮發(fā)性。
這些物質(zhì)常帶有大量的極性官能團,加熱時(shí)易分解;有助于混合物的分離;使用ECD檢測,分析物檢測下限可降低很多。常用的酰基化試劑有:乙酸酐(AA)、三氟乙酸酐(TFAA)、五氟丙酸酐(PFPA)、七氟丁酸酐(HFBA)、N-甲基雙(三氟乙酸酐)咪唑(MBTFA)、1-(三氟乙酰)咪唑(TFAI)等。
烷基化作用是將烷基官能團(脂肪族或脂肪,芳香族)添加到活性官能團(H)上。以烷基基團代替氫的重要性在于生成的衍生物與原來(lái)化合物相比極性大為下降。
該試劑常用于修飾改良含有酸性氫的化合物如羧酸和苯酚。生成的產(chǎn)物有醚,酯,硫醚,硫酯,正烷基胺和正烷基酰胺。
弱酸性官能團(如醇)的烷基化要求有強堿催化劑(氫氧化鈉,氫氧化鉀)。酸性稍強的OH基團如苯酚和羧酸,弱堿催化劑(氯化氫,三氟化硼)即可。
常用的烷基化試劑有重氮甲烷、2,2二甲基丙烷(DMP)、18-冠醚-6、硼酸正丁酯(NBB)、O-鹽酸甲氧基胺、五氟芐基溴(PFBBr)、N-甲基-N-亞硝基對甲苯磺酰胺(Diazald)、N,N-二甲基甲酰胺二縮叔乙醛(DMF-DBA)、N,N-二甲基甲酰胺二縮乙醛(DMF-DEA)、N,N-二甲基甲酰胺二縮甲醛(DMF-DMA)、N,N-二甲基甲酰胺二縮丙醛(DMF-DPA)、1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(MNNG,97%) 、三甲基苯胺——(TMAH)等。 常用紫外衍生化試劑⑴2,4-二硝基氟苯(最大吸收波長(cháng)350nm,摩爾吸收系數>104)⑵對硝基苯甲酰氯(最大吸收波長(cháng)254nm,摩爾吸收系數>104)⑶ 對甲基苯磺酰氯(最大吸收波長(cháng)224nm,摩爾吸收系數=104)⑷異硫氰酸苯酯(最大吸收波長(cháng)244nm,摩爾吸收系數=104)⑸ 對硝基苯基溴(最大吸收波長(cháng)265nm,摩爾吸收系數6200 )⑹ 對溴代苯甲酰甲基溴(最大吸收波長(cháng)260nm,摩爾吸收系數=1.8*104)⑺ 萘酰甲基溴(。
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